Эксцизионная репарация оснований Christmann et al 2003 Toxicology

Эксцизионная репарация оснований Christmann et al. (2003) Toxicology 193: 3– 34

ДНК-гликозилазы E. coli и человека E. coli человек Ung UNG U в оц- и дц. ДНК, любой контекст Mug TDG U в U: G, T в T: G (TDG), этеноцитозин SMUG 1 MBD 4 специфичность U в оц- и дц. ДНК, гидроксиметилурацил, формилурацил U в U: G, T в T: G в Cp. G-островках Tag алкилированные в кольцо пурины Alk. A алкилированные в кольцо пурины, гипоксантин, этеноаденин MPG алкилированные в кольцо пурины, гипоксантин, этеноаденин Nth NTHL окисленные пиримидины Nei NEIL 1 окисленные пиримидины NEIL 2 окисленные пиримидины NEIL 3 ? Fpg окисленные пурины OGG 1 Mut. Y MUTYH окисленные пурины A и 2 -OH-A напротив G или 8 -oxo. G суперсемейство Ung суперсемейство Nth суперсемейство Fpg/Nei суперсемейство формилтрансфераз

ДНК-гликозилазная активность: гидролиз N-гликозидной связи

равновесие между закрытой (гемиацетальной) и открытой (альдегидной) формами АП-сайта

АП-эндонуклеаза: гидролиз фосфодиэфирной связи

дезоксирибо-5’фосфатлиаза: b-элиминация

транс-2 -гидрокси-5 оксопентен-3 -фосфат

ДНК-гликозилазная активность: гидролиз N-гликозидной связи АП-лиазная активность: b-элиминация

АП-эндонуклеаза: гидролиз фосфодиэфирной связи

транс-2 -гидрокси-5 оксопентен-3 -фосфат

АП-лиазная активность: d-элиминация ДНК-гликозилазная активность: гидролиз N-гликозидной связи АП-лиазная активность: b-элиминация

АП-эндонуклеаза или полинуклеотидкиназа / 3’-фосфатаза: гидролиз фосфоэфирной связи

Болезни, связанные с дефектами эксцизионной репарации оснований ген заболевание UNG гипериммуноглобулинемия M TDG рак ободочной и прямой кишки SMUG 1 рак ободочной и прямой кишки MBD 4 рак ЖКТ, эндометрия, поджелудочной железы MPG рак ободочной и прямой кишки NTHL неизвестны NEIL 1 рак ободочной и прямой кишки; рак желудка NEIL 2 рак ободочной и прямой кишки NEIL 3 неизвестны OGG 1 рак легкого, ЖКТ, простаты рак почки аденоматозный полипозный рак ободочной кишки рак желудка MUTYH рак легкого доказана причинно-следственная генетическая связь эпидемиологическая ассоциация утеря гетерозиготности в клетках опухоли

Мыши с инактивированными генами ДНКгликозилаз ген фенотип UNG B-клеточные лимфомы у старых животных TDG — SMUG 1 — MBD 4 мутации C®T в Cp. G-островках MPG чувствительность к алкилирующим агентам NTHL нет фенотипа NEIL 1 метаболический синдром; иммунодефицит NEIL 2 — NEIL 3 — OGG 1 рак легких у старых животных MUTYH нет фенотипа клинический фенотип биохимический фенотип

-T-A-C-G-A-A-T-G-C-TAID -T-A-U-G-A-A-T-G-C-TUNG АП-эндонуклеаза -T-A---G-A-A-T-G-C-T- репликация -T-A- -G-A-T-A-C-G-A-T-A---G-A+ -A-T-G-C-T-A-T-X-C-Tошибочная репликация репарация -T-A-X-G-A-T-A-Y-G-A-A-T-G-C-T-A-T-X-C-T-

Образование хугстеновской пары 8 -oxo. G: A 8 -oxod. G(syn) • d. A(anti) 8 -oxod. G(anti) • d. C(anti)

Схема функционирования GO-системы [O] репликация ДНК-полимераза (Fpg) OGG 1 3 -’фосфодиэстераза ДНК-полимераза лигаза репликация ДНК-полимераза MUTYH АП-эндонуклеаза ДРФаза ДНК-полимераза лигаза 3 -’фосфодиэстераза ДНК-полимераза лигаза

MUTYH: известные полиморфизмы

MUTYH: медико-генетические рекомендации ü генотипирование в случае аутосомнорецессивного наследования рака ободочной и прямой кишки в родословной ü превентивная колонэктомия в возрасте 20– 30 лет в случае гомозиготного или составного гетерозиготного генотипа по известным инактивирующим мутациям MUTYH

Ферменты репарации как лекарства липосомы, содержащие: ü фотолиазу ü Den. V фага T 4 AGI Dermatics

Ферменты репарации как лекарства Находятся на стадии клинических испытаний в фазе III для предотвращения солнечного кератоза у пациентов с пигментной ксеродермой и в фазе II для предотвращения повторного развития рака кожи у пациентов, подвергающихся лечению иммунодепрессантами после трансплантации почки липосомы, содержащие: ü фотолиазу ü Den. V фага T 4

Ферменты репарации как лекарства липосомы, содержащие: ü Fpg ü OGG 1 ü MUTYH доклинические испытания для предохранения клеток от генотоксичных воздействий (противоопухолевая терапия, O 2)

Эксцизионная репарация оснований TDG, SMUG 1, MBD 4 Снижают эффективность действия противоопухолевых средств — аналогов урацила: ü 5 -фторурацил ü 5 -иододезоксиуридин MPG Снижает эффективность действия алкилирующих противоопухолевых средств: ü дакарбазин ü темозоломид

Ингибиторы ферментов репарации как лекарства метоксиамин химически модифицирует AP-сайты фаза I клинических испытаний (в комбинации с темозоломидом)

Ингибиторы ферментов репарации как лекарства CRT 0044876 лукантон ингибиторы AP-эндонуклеазы доклинические испытания

Эксцизионная репарация оснований урацил-ДНК-гликозилазы вирусов Необходимы для репликации: ü герпесвирусов (вирус простого герпеса, вирус ветряной оспы, вирус Эпштейна–Барр, цитомегаловирус) ü поксвирусов (вирус натуральной оспы, вирус коровьей оспы, вирус осповакцины, вирус контагиозного моллюска) ü лентивирусов (вирус иммунодефицита человека)

Ингибиторы ферментов репарации как лекарства ингибиторы урацил-ДНК-гликозилазы доклинические испытания

Сайт-направленный мутагенез: метод Кункеля U U U U U

Сайт-направленный мутагенез: метод Кункеля U U U U U

Сайт-направленный мутагенез: метод Кункеля U U U U U

Предотвращение контаминации ПЦР-реакций ~ ~~ ДНК-матрица – + d. ATP, d. CTP, d. GTP, TTP ~ ~~ ДНК-матрица – + d. ATP, d. CTP, d. GTP, d. UTP обработка Ung перед ПЦР

Безрестриктазное клонирование ПЦР-продуктов 5’-AGCUTACNNN. . . . NNNTGACGT-3’ 3’-TCGAATGNNN. . . . NNNACUGCA-5’ Ung, затем щелочь или AP-эндонуклеаза Sac. I TACNNN. . . . NNNTGACGT TCGAATGNNN. . . . NNNAC ДНК-лигаза AGCTTACNNN. . . . NNNTGACGT TCGAATGNNN. . . . NNNACTGCA Aat. II

Принцип метода кометографии (comet assay) Singh et al. (1988) Exp. Cell. Res. 175: 184 -91 Клетки с разным количеством разрывов ДНК Электрофорез в агарозном геле

Варианты метода кометографии Электрофорез в неденатурирующем геле двухцепочечные разрывы одноцепочечные разрывы Электрофорез в щелочном геле апурин-апиримидиновые сайты Предварительная обработка ферментами репарации; электрофорез в щелочном геле поврежденные основания

Организмы-индикаторы