Дризе Нина Иосифовна Гематологический Научный Центр МЗ России

Скачать презентацию Дризе Нина Иосифовна Гематологический Научный Центр МЗ России

1. Обзор кроветворения 2016.pptx

Количество слайдов: 110

Дризе Нина Иосифовна Гематологический Научный Центр МЗ России, лаборатория Физиологии Кроветворения ndrize@yandex. ru

Точка зрения клеточного биолога молекулярного физиолога биолога

Кроветворение - это образование и развитие клеток крови

Наработка и гибель клеток крови (фабрика) Каждую минуту в костном мозге производится 300 000 клеток 5 тонн клеток крови

Соблюдение баланса Клетки крови должны быть вовремя наработаны и вовремя умереть. 1. Как обеспечить такую огромную клеточную продукцию? 2. Как обеспечить своевременную гибель клеток?

В основе поддержания системы лежат стволовые кроветворные клетки (СКК) Определение 1. СК способны к дифференцировке во все клеточные линии данной ткани; 2. СК способны к самоподдержанию, то есть к воспроизведению себе подобных.

То, что видят морфологи в световой микроскоп в костном мозге

То, что «не видят» , а определяют в костном мозге физиологи, оперирующие функциональными тестами LT-HSC ST-HSC

Функциональные тесты 1. Стволовые кроветворные клетки (СКК) Восстановление кроветворения у летально облученных животных. 2. Полипотентные кроветворные клетки предшественники Колониеобразующие единицы в селезенке (КОЕс-CFU-S). Колониеобразующие единицы в культуре (КОЕк- КОЕ-ГМ, КОЕ-Э, КОЕ-М, БОЕ-Э). (CFU-C-CFU-GM, CFU-E, CFU-M, BFU-E) Клетки образующие области булыжника в культуре (КООБ-CAFC).

Функциональные тесты Восстановление кроветворения у летально облученных животных. 1. Облучение – летальная доза для разных линий животных разная – От 8, 5 до 12 Gy 2. Введение клеток внутривенно 3. Необходимое количество клеток: для мыши – 100000 (вводят 250000) для человека 108 на кг веса (вводят 3 х108 на кг )

А. Восстановление кроветворения у летально облученных животных Метод лимитирующих разведений 1 группа – 100 000 клеток костного мозга 2 группа– 50 000 клеток костного мозга 3 группа – 25 000 клеток костного мозга 4 группа – 12 500 клеток костного мозга

Восстановление кроветворения у летально облученных животных Метод лимитирующих разведений 1. Анализ количества выживших в течение 4 -х месяцев животных 2. Определение количества длительно репопулирующих стволовых клеток (LT-HSC) по формуле Пуассона Среднее количество LT-HSC = - ln a/N, где а –количество умерших мышей в данном разведении N – общее количество мышей

Б. Метод конкурентной репопуляции Схема эксперимента. Опытная группа: Контрольная группа: CD 45. 1+ CD 45. 2+ Костный мозг Смеси КМ (группы): + 10 Гр CD 45. 2+ 1 часть КМ самца + 1 часть КМ самки 1 часть КМ самца + 3 часть КМ самки 1 часть КМ самца + 19 часть КМ самки + 10 Гр У восстановленных мышей через 3, 10 и 16 месяцев берут костный мозг и трансплантируют вторичным облученным реципиентам. Изучают, какому полу принадлежат КОЕс или маркеры клеток в периферической крови. Золотой стандарт для определения СКК

То, что «не видят» , а определяют в костном мозге физиологи, оперирующие функциональными тестами LT-HSC ST-HSC

Функциональные тесты Б. Полипотентные кроветворные клетки предшественницы 1. Колониеобразующие единицы в селезенке (КОЕс-CFU-S). 2. Колониеобразующие единицы в культуре (КОЕк- КОЕ-ГМ, КОЕ-Э, КОЕ-М, БОЕ-Э). (CFU-C-CFU-GM, CFU-E, CFU-M, BFU-E) 3. Клетки образующие области булыжника в культуре (КООБ-CAFC).

James Till, MD, left, and Ernest Mc. Culloch, MD, in 2005.

Колониеобразующие единицы в селезенке (КОЕс) (Till, Mc. Cullock, 1961) Эритроидная Гранулоцитарная Облучение 10 Gy Мегакариоцитарная 7 -14 дней Недифференцированная

Колониеобразующие единицы в селезенке (КОЕс)

Колония в селезенке происходит из 1 клетки Облучение 3 Gy Облучение 10 Gy 7 -14 дней Все клетки колонии несут один и тот же маркер.

Способность КОЕс к самоподдержанию (пролиферативный потенциал) Облучение 10 Gy Определение числа дочерних колоний

Гетерогенность КОЕс по пролиферативному потенциалу

Колонии в селезенке происходят из разных предшественников (тестирование в разные сроки после инъекции клеток костного мозга) 8 суток 12 суток

a) ST-HSC, b) IT-HSC, c, d) LT-HSC Ema-2014

Моноклональные антитела (1975) 1976/1977, Нобелевская 1984 Цезарь Мильштейн и Джорж Келлер

Как же все-таки «поймать» стволовые клетки? Science. 1988 Jul 1; 241(4861): 58 -62. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Spangrude GJ, Heimfeld S, Weissman IL.

Маркеры стволовых клеток

Сочетание работы клеточных биологов и физиологов позволило определить некоторые маркеры кроветворных клеток http: //en. wikipedia. org/wiki/List_of_human_clusters_of_differentiation Type of cell CD markers stem cells CD 34+, CD 31 - all leukocyte groups CD 45+ Granulocyte CD 45+, CD 15+ Monocyte CD 45+, CD 14+ T lymphocyte CD 45+, CD 3+ T helper cell CD 45+, CD 3+, CD 4+ Cytotoxic T cell CD 45+, CD 3+, CD 8+ B lymphocyte CD 45+, CD 19+ or CD 45+, CD 20+ Thrombocyte CD 45+, CD 61+ Natural killer cell CD 16+, CD 56+, CD 3 www. e. Bioscience. com

Сортировка клеток на бусах

Гетерогенность СКК Маркеры стволовых клеток CD 34 c-kit • Маркеры стволовых клеток • СD 34 – молекула адгезии • CD 38 – фермент активный в Т и В клетках • c-kit – рецептор фактора роста СКК • Sca 1 - молекула адгезии (stem cell antigen) • Rho low • Ho low • CD 33 – молекула адгезии • CD 150 - SLAMF 1 (Signaling lymphocytic activation molecule) • • CD 135 - fms-like tyrosine kinase receptor-3 (Flt 3), fetal liver kinase-2 (Flk 2) CD 48 - SLAMF 2

Y Y Y Выделение стволовых клеток В Т Б М Эо Y Н Ter 119 и рецептор к трансферину Y Y

Выделение стволовых клеток CD 34 c-kit

Fillipovich - lecture -2009

«Похоже на стволовую клетку»

Гетерогенность СКК Cho-2008

Гетерогенность СКК Линия мышей С 57 Bl 6 Balb/c DBA/2 C 57 Bl 6 Старые Balb/c Старые DBA/2 Старые Соотношение лимфоцитов и миелоцитов • Было показано, что существуют миелоидные и лимфоидные СКК. • С возрастом их соотношение меняется и миелоидные начинают доминировать.

Трансплантация 1 клетки и классификация (Ema-2014) • Proportion Lymphoid to myeloid cells • L/M (% lymphoid cells) + (% myeloid cells) = 100) • My-bi 1 отсортированная клетка (Ly 5. 1)+ 200000 клеток • Ly-bi • Bala Летальное облучение – 1000 rad

Ema-2014

Гетерогенность СКК Muller-Seiburg-2012

Кинетика восстановления кроветворения разными СКК My-bi Ly-bi Bala Ema-2014

Модели иерархии СКК Ema-2014

Дифференциальная модель иерархии СКК Ema-2014

Модель различных уровней экспансии СКК • CD 45+EPCR+CD 48 -CD 150+(ESLAM) cells My-bi Bala Benz-2012

Yamamoto-2013

Определение репопулирующих стволовых клеток Definition of repopulating cell: When all five types of mature blood cells in an individual mouse showed STABLE CHIMERISM (0. 1% OR MORE) 20 WEEKS AFTER SECONDARY TRANSPLANTATION, the original single cell was retrospectively defined as a long-term HSC (LT-HSC). When five types of mature blood cells in an individual mouse showed CHIMERISM (0. 1% OR MORE) 24 WEEKS AFTER PRIMARY TRANSPLANTATION BUT AT LEAST ONE LINEAGE DISAPPEARED IN SECONDARY RECIPIENT MICE, the original single cell was defined as an intermediate-term HSC (IT-HSC). When, in a primary recipient mouse, mature blood cells of at least ONE LINEAGE DISAPPEARED (THAT IS, SHOWED LESS THAN 0. 1% CHIMERISM) BEFORE 24 WEEKS AFTER TRANSPLANTATION, the original single cell was defined as a shortterm HSC (ST-HSC). When only neutrophils/monocytes, erythrocytes, and platelets, but not cells of B and T lineages, were detected in mice, the original single cell was defined as a common myeloid repopulating pro-genitor (CMRP). When only erythrocytes and platelets were detected in mice, the original single cell was defined as a megakaryocyte-erythroid repopulating progenitor (MERP). When only platelets were detected in mice, the original single cell was defined as a megakaryocyte repopulating progenitor (Mk. RP) Yamamoto-2013

Пропорция донорских клеток разных линий дифференцировки Yamamoto-2013

Распределение СКК по фракциям Yamamoto-2013

Гетерогенность СКК – теория пластов В 1977 году А. И. Воробьевым была выдвинута гипотеза о возрастных пластах стволовых клеток, существо которой сводится к предположению о качественном различии стволового класса клеток в разные периоды жизни человека. В основе гипотезы лежали клинические наблюдения за лейкозами, неодинаковыми по форме в разные возрастные периоды или обнаруживающими качественные различия одной и той же формы в зависимости от возраста пациента.

Пролиферация и состояние покоя СКК Wilson 2008

Мыши получали 1 внутрибрюшинную инъекцию Budr 180 mg, а затем их поили водой с Budr 800 mg на мл Через 70 дней Wilson 2008

Пролиферация и состояние покоя СКК

Пролиферация и состояние покоя СКК За жизнь мыши СКК проделывают всего 5 делений (1 раз в 145 дней)

Пролиферация и состояние покоя СКК

A Stem Cell Apostasy: a Tale of 4 H Words Quesenberry-2014 -Stem. Cells • • • Это рассмотрение четырех слов на Н. Hierarchy Иерархия - стандартное описание для систем стволовых / прогениторных клеток. Мы использовали это слово на H в нашем «отсталом» прошлом. Есть 4 определения иерархии в Оксфордском словаре английского языка. Первые три относятся к "подразделению ангелов и церковной организации". Четвертое относится к " телам или вещам, ранжированных на классы, расположенных один над другим. " Мы предполагаем, что термин иерархия используется для описания систем стволовых клеток. Четвертый смысл подразумеваемых, хотя, учитывая «религиозную» приверженность к некоторым нынешним догмам, связанных со стволовыми клетками, возможно, использование и первых трех может быть целесообразным. Другим важным H является слово homogeneity однородность. Это, кажется, цель большинства ученых, пытающихся получить чистые фракции стволовых клеток. «Однородная» определяется как "состоящая из частей или элементов одного и того же рода". Характеристика, вероятно, недостижимая для биологических систем.

A Stem Cell Apostasy: a Tale of 4 H Words • • Наши концепции могут быть и были описаны как heterodox еретические , то есть «поддерживающие мнения, не являющиеся правильными, т. е. ‘orthodox’. " Первое определение в словаре "поддержание. доктрин, мнений и т. д. , не в соответствии с установленными доктринами, мнениями, которые обычно признаны правильными или «ортодоксальными» . Ортодоксальный взгляд на биологию стволовых клеток состоит в признании наличия иерархической популяции. В этом случае для получения однородной популяции стволовые клетки не должны делиться. А они делятся! Ключевым в этой системе является невозможность очистки популяции стволовых клеток до однородности. Наша неортодоксальность проявляется в том, что изменения в популяции стволовых клеток не иерархические, стволовые клетки активно пролиферируют, и соответственно постоянно меняется фенотип. Это приводит нас к очень важному окончательному H heterogeneity Неоднородность. Это, конечно, противоположный однородности вариант и лучше рассматривать его как "Разницу или разнообразие вещей. "

Quesenberry-2014 -Stem. Cells Стандартная модель иерархии

Quesenberry-2014 -Stem. Cells Figure 2. Stem cell potential within un‐separated marrow is lost with stem cell purification. The multi‐colored circles represent the total population of marrow cells. The nonstem cells are in blue, the conventional, highly purified stem cells are represented in red, while all other colors represent marrow cells with stem cell potential. Isolation of the small subset of highly purified quiescent stem cells leads to underrepresentation of the total stem cell potential within marrow.

Quesenberry-2014 -Stem. Cells Figure 3. A Stem Cell Continuum. This model shows the continuous fluctuation of progenitor/ stem cell phenotype with passage through cell cycle. LT ‐ HSC = long - term hematopoietic stem cell.

Общая информация о кроветворении

Пирамида кроветворных субпопуляций • Кроветворение идет в одном направлении • Пролиферативный потенциал уменьшается • Не происходит смены линейной дифференцировки СКК Коммитированные предшественники Делящиеся и Созревающие клетки

Основные принципы продукции клеток крови • • 1. 2. Клетки крови имеют короткую продолжительность жизни. Клетки крови на поздней стадии дифференцировки и зрелые не делятся. В организме должен быть либо запас стволовых клеток, либо они должны пополняться. Для продукции требуемого количества нормально функционирующих клеток необходимо: пролиферация исходных клеток дифференцировка клеток по мере деления.

Где происходит кроветворение? Места кроветворения: • Эмбрион: желточный мешок, область Аорты-Гонады-Мезонефроса, печень, селезенка. . • Зародыш: печень, селезенка, костный мозг. . • После рождения: костный мозг. . • Молодые особи: длинные и плоские кости. • Взрослые особи: плоские кости и окончания длинных костей.

Развитие зачатка крови Baron 2012

Развитие зачатка крови – примитивный и дефинитивный гемопоэз Clements-2013

Clements-2013

Некоторые сигнальные молекулы в развитии зачатка крови Clements-2013

Образование кроветворных клеток в области дорзальной аорты (рыба вьюнок) Kissa, 2010

Образование кроветворных клеток в области аорты-гонады-мезонефроса (зародыш мыши) time-lapse confocal imaging new dissection procedure GFP c-kit+ CD 34+ Ly-6 A-GFP Boisset, 2010

Образование кроветворных клеток в области аорты-гонады-мезонефроса (зародыш мыши) GFP c-kit+ CD 34+ Boisset, 2010

Развитие СКК из эндотелия

Образование кроветворных клеток в области дорзальной аорты Вьюнок Мышь/Человек Swiers, 2010

Регуляция образования кроветворных клеток Cbfb-core-binding factor, beta subunit Tek –tyrosine kinase, endothelial Ly 6 a-lymphocyte antigen 6 complex Сhen-2011

Intraaortic hematopoietic clusters at E 10 are phenotypically heterogeneous and contain very few progenitors but contain pre-HSCs able of long-term multilineage hematopoietic reconstitution after transplantation in WT neonates. Boisset J et al. Blood 2015; 125: 465 -469 © 2015 by American Society of Hematology

Стадии эмбрионального кроветворения у человека

Кроветворение в эмбриональной печени кошки (в основном эритропоэз)

Ядерные эритроциты в крови эмбриона коровы

Места возможного получения аспиратов костного мозга

Места кроветворения у взрослых

Распределение кроветворной ткани в организме мыши Бедра 10% Ребра 8% Тазовые кости 7% Плечи 5% Голени 4% Череп 11% Другие места 3% Позвоночник 52% Quesenberry P. J.

Вид костного мозга на срезе

Вид костного мозга на отпечатке

Мазок костного мозга с мегакариоцитом

Микрофотография костного мозга на сканирующем электронном микроскопе

Guezguez-2013 -CSC

Куда попадают СКК после трансплантации? Guezguez-2013 -CSC

Изменения в экспрессия генов в СКК в зависимости от места Guezguez-2013 -CSC

Возможные изменения ниш Guezguez-2013 -CSC

Трехмерная архитектура костного мозга воспроизведенная с помощью конфокального микроскопа Takaku-2010

differential interference contrast (DIC) Takaku-2010

Takaku-2010

Заболевания в костном мозге человека

Трехмерная архитектура костного мозга после трансплантации клеток костного мозга LSC – Lin-, Sca 1+, c-kit+ Takaku-2010

Трехмерная архитектура костного мозга после трансплантации клеток костного мозга Takaku-2010

2009 2009

Ткани, участвующие в кроветворении • В костном мозге –продуцируется большинство клеток крови • В лимфатических узлах, тимусе и селезенке – продуцируется большинство лимфоцитов • Печень, селезенка и костный мозг – хранилище железа • Почки – продуцируют эритропоэтин • Эндотелий, клетки воспаления – продуцируют множество стимуляторов кроветворения • Кишечник – источник питания

Резервы кроветворной ткани • При запросе на клетки крови неактивные участки костного мозга, состоящие в основном из жировых клеток, переходят в активное состояние и начинают продуцировать клетки крови. • Аналогично в селезенке и печени возможна продукция кроветворных клеток при экстремальном запросе на клетки крови. Такая активность называется экстамедулярным кроветворением и случается очень редко при отсутствии трансформации.

Продолжительность жизни клеток крови • • Эритроциты 90 -120 дней Тромбоциты 10 -14 дней Гранулоциты 8 -10 часов Лимфоциты от 2 дней до многих лет