Доклад на тему: “Методы анализа ДНК – диагностика

Доклад на тему: “Методы анализа ДНК – диагностика наследственных заболеваний. ” Подготовил: Загидуллин Шамиль 106 (гр)

§ ДНК-диагностика — это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования. ДНК-анализы широко применяются в диагностике инфекционных заболеваний , позволяя обнаруживать даже единичные микроорганизмы в организме человека. § ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самый распространенный из них — метод ПЦР (полимеразной цепной реакции).

ПЦР диагностика § ПЦР — (Polymerase chain reaction, PCR diagnostics) расшифровывается как полимеразная цепная реакция. § ПЦР диагностика — это метод лабораторной диагностики инфекционных заболеваний, в частности, этот метод широко применяется и для диагностики ЗППП — заболеваний, передающихся половым путем. § Анализ методом ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции, которую подозревает врач. «Небольшой фрагмент ДНК» — это несколько сотен пар оснований ДНК — кирпичиков, расположенных в строго определенной последовательности, и потому образующих неповторимый узор. Для ПЦР-диагностики инфекций достаточно небольшого фрагмента, поскольку любая ДНК включает в себя не менее нескольких тысяч оснований.

§ При проведении ПЦР-анализа ведется поиск такого фрагмента ДНК инфекции, который специфичен только для данного микроорганизма. Это значит, что этот фрагмент ДНК «особенный» — он встречается только у этого микроба (или группы родственных микробов), но не встречается ни у одного другого микроба. § Сама полимеразная цепная реакция (пцр диагностика) используется для того, чтобы найденный фрагмент размножить, клонировать: чтобы однозначно «увидеть» эти фрагменты ДНК, к окончанию реакции их должно быть не мене 1012 штук.

Анализ ДНК при помощи ПЦР

История открытия ДНК и разработки метода ПЦР Первоначально сам принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) был разработан Кэри Мюллисом в 1983 г. Открытие ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет, и за разработку ПЦР-анализа Кэрри Мюллис уже в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии. Появлению метода проведения полимеразной цепной реакции предшествовали определенные достижения молекулярной генетики: к тому времени уже были расшифрованы нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов и выделены специфические. Также появлению ПЦР много способствовало открытие уникального фермента ДНК-полимеразы (или taqполимеразы). Именно этот фермент катализирует и «контролирует» все процессы во время проведения анализа методом ПЦР. Особенность этого фермента — он термостабилен, исключительно термостоек: он выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности, а «любимый» его температурный режим во время работы — 72 о. С. Многие реакции проведении ПЦР идут почти исключительно при повышенной температуре.

§ С момента появления метода, ПЦР-исследования завоевывают все большую и большую популярность. Врачи , лаборанты и микробиологи, без преувеличения, просто в восторге от этого метода – диагностика пцр. По словам врачей и лаборантов нашего медицинского центра «Евромедпрестиж» , ПЦР-анализ прост в исполнении, обладает непревзойденными показателями чувствительности и специфичности. Все эти показатели способствовали тому, что диагностика методом ПЦР стремительно распространилась по всему миру. § В настоящее время метод ПЦР-диагностики развивается семимильными шагами. Во всем мире совершенствуются, модифицируются и разрабатываются всевозможные модификации ПЦР-анализа. Каждый год на медицинский рынок поступает десятки новых разработок и тест-систем ПЦРдиагностики, предназначенных для выявления нуклеотидных последовательностей различных микроорганизмов — возбудителей инфекционных заболеваний. Новые разработки для проведения ДНК-исследований с каждым разом снижают себестоимость ПЦР-анализа, делая его доступным для широкого использования в диагностических и лечебных целях.

Материал для сдачи ПЦРанализа § Материалом для проведения ПЦР-диагностики может служить: § • соскоб эпителиальных клеток (соскоб из уретры у мужчин и у женщин, соскоб из цервикального канала) • кровь, плазма, сыворотка крови • биологические жидкости (сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкости, слюна) • моча (используется первая порция утренней мочи) • мокрота • биопаты желудка и двенадцатиперстной кишки • слизь и другие биологические выделения

§ Достоверность результатов лабораторной диагностики пцр зависит не только от опыта и профессионализма врача-лаборанта, возможностей данной лаборатории, но и от того, соблюдал ли пациент рекомендации врача, насколько правильной была его подготовка к проведению анализа. На самом деле ничего сложного в правильной подготовке нет. При сдаче анализа методом ПЦР врачи рекомендуют соблюдать следующие правила: § • За сутки до проведения анализа не жить половой жизнью • Сдача ПЦР анализа крови проводится натощак, т. е. необходимо ничего не есть, не пить и не жевать жвачку • Для ПЦР-анализа мочи используется первая утренняя порция, собранная в чистый, стерильный контейнер § Результат ПЦР-диагностики обычно можно получить через 1, 5— 2 суток после сдачи анализа. Возможно получение результатов ПЦР -теста в течение одного дня.

Достоинства и недостатки ПЦРдиагностики § Мазок методом ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний обладает следующими преимуществами: § • Прямое определение возбудителей инфекционных заболеваний. Многие традиционные методы лабораторной диагностики подразумевают выявление возбудителей заболевания по различным косвенным признакам. Например, ИФА-диагностика основана на обнаружении в крови пациента белков, являющихся продуктами распада инфекционных возбудителей, на основании чего врач может поставить тот или иной диагноз. Метод ПЦР-анализа дает прямое указание на присутствие в забранном у пациента материале специфического участка ДНК возбудителя болезни. § • Высокая специфичность ПЦР-диагностики. В процессе проведения анализа в исследуемом материале выделяется фрагмент ДНК, специфичный, т. е. присущий только конкретному возбудителю - только определенной бактерии или вирусу. Данный участок ДНК уникален и не характерен ни для одной инфекции на земле.

§ • Высокая чувствительность ПЦР. Обнаружение инфекции возможно даже в том случае, если в забранном у пациента материале содержится лишь одна клетка бактерии или вируса. По сравнению с другими иммунологическими и микробиологическими методами диагностики: чувствительность ПЦР-анализа — 100 клеток в пробе, другие методы - 103— 105 клеток. § • Универсальность ПЦР-анализа. Для ПЦР-исследования может применяться практически любые материалы, в том чиле недоступные для исследования другими методами: слизь, моча, кровь, сыворотка, мокрота, эякулят, соскоб эпителиальных клеток - поскольку инфекция может содержаться в любых биологических выделениях и тканях.

§ • Высокая скорость получения результата ПЦР-анализа. Единый для всех метод обработки забранного на анализ у пациента материала, детекции продуктов реакции, автоматизированная ПЦР-амплификация позволяются провести полную ПЦР-диагностику за 4— 5 часов. В тоже время, на культуральные методы исследования затрачивается гораздо больше времени — от нескольких дней до нескольких недель, поскольку необходимо выделение, а затем и выращивание возбудителя на культуре клеток. § • Возможность диагностики любого вида инфекции. Высокая чувствительность метода ПЦР позволяет диагностировать инфекцию не только на острой стадии заболевания, но и хронические инфекции и даже наличие единичных бактерий или вирусов.

§ Мазок методом ПЦР позволяет выявить инфекции, которые невозможно обнаружить в мазке на флору: хламидиоз , уреаплазмоз , микоплазмоз , генитальный герпес. § Какими бы значительными достоинствами не обладал метод исследования, но и ПЦР-диагностика имеет некоторые ограничения. К недостаткам ПЦР-диагностики можно отнести: § • Возможность получения ложноположительного результата ПЦР-анализ может показать положительный результат даже в том случае, если инфекция уже мертва, «убита» антибиотиками, но ее мертвые клетки все еще содержатся в тканях пациента. Как такое возможно? Очень просто. Например, инфекция живет в клетках эпителия (на слизистой половых органов или глаз). И ее полечили. Но для «обновления» клеток эпителия требуется время. Если материал будет забран врачом до срока полного обновления клеток, в материале могут содержаться мертвые клетки инфекции. Клетки, очевидно, содержат генетический материал — ДНК или РНК возбудителя, который и «ищет» ПЦР не отличает мертвые клетки от живых: она ищет ДНК, и «клонирует» их в огромных количествах. Результат такого анализа положительный. В действительности же он является ложноположительным

§ Неспособность ПЦР «отличить» мертвую инфекцию от живой налагает определенные требования при использовании ПЦР и для контроля эффективности лечения. Основное правило, конечно же, дождаться полного выведения мертвых остатков инфекции из организма, что у среднего человека происходит в течение 4— 8 недель. По истечении этого срока после приема последней таблетки антибиотика метод ПЦР можно и нужно использовать для контроля эффективности проведенного лечения. § На более ранних сроках контроль излеченности можно произвести только с помощью культурального метода, или посева: признаком неизлеченности могут служить только жизнеспособные размножающиеся микроорганизмы. § • Нежелательно использовать ПЦР-анализ для диагностики гарднереллеза , так как гарднереллы — возбудители этого заболевания в небольшом количестве в норме живут во влагалище. ДНК этих бактерий же при использовании ПЦР будет раз за разом находиться. Гарднерелл не должно быть в мазке, и бактериоскопия в данном случае — достаточный метод для диагностики гарднерелллеза и контроля лечения.

§ Таким образом, различные тест-системы — одна из причин, почему анализы, сделанные в разных лабораториях и в разных клиниках «одним и тем же» методом ПЦР могут показывать диаметрально противоположные результаты. Чтобы максимально избегать ошибок по вине мутаций, в настоящее время разработаны стандарты, регламентирующие объем испытаний (включая проверку на перекрестные реакции, а также тестирование известных штаммов определяемого возбудителя), которые должна выдержать тест-система, прежде чем она попадет на рынок и будет использована для диагностики вашего здоровья. Вот почему хорошие клиники и лаборатории используют последние поколения тест-систем. И наш медицинский центр «Евромедпрестиж» один из немногих, кто может предложить своим клиентам качественную диагностику.

ПЦР и ИФА-диагностика § Как и анализ ПЦР, ИФА-методы широко применяются в современной лабораторной диагностике ИППП. При чем врач может назначить Вам не только сдать ПЦР анализ, но и провести ИФА — диагностику для выявления определенной инфекции. С непрофессиональной точки зрения пациента подобный комплекс исследования вызывает много вопросов, поскольку все лабораторные методы исследования на первый взгляд кажутся абсолютно одинаковыми. Но, несмотря на внешнюю схожесть, разница между ПЦР, ИФА и другими иммунологическими исследованиями все же есть.

§ ИФА-анализ основан на выявлении не самой инфекции, а ее продуктов жизнедеятельности — белов-маркеров. ПЦР-анализ напротив выявляет существующие в настоящее время инфекционные агенты (бактерии, вирусы, грибы). § РИФ, как и другие иммунологические методы исследования, тоже несколько уступает достоверности ПЦР-инфекции. Суть РИФ такова, при проведении анализа антигены возбудителя (молекулы белка, свойственные инфекции) ищут антителами к ним. Если антитело «обнаружит» белок, антиген инфекции, значит потенциально человек инфицирован. Однако свойство антитела таково, что они могут реагировать не с одним, а с разными антигенами — так называемые перекрестно-реагирующие антигены. Из-за этого специфичность (способность метода выявлять лишь тот инфекционный агент, для которого данный метод исследования назначен) у РИФ чуть ниже, чем у ПЦР.

§ Случается, что результаты ПЦР и ИФА-диагностики могут не совпадать. Обычно это происходит вследствие нескольких причин: § • «Иммунологический след» — «след» от уже перенесенной инфекции. В ответ на внедрение инфекции организм начинает вырабатывать антитела, в частности, антитела класса Ig. G. Эти антитела «улавливает» ИФА-анализ. Метод ПЦР реагирует только на наличие молекул ДНК инфекции в организме. В такой ситуации ПЦР-анализ дает отрицательный результат, а ИФА — положительный. При чем в связи с индивидуальными особенностями иммунной системы положительный результат ИФА-диагностики, вызванный повышенным содержанием антител, может сохраняться несколько месяцев и даже лет после полного выздоровления.

§ • Разница в оборудовании для проведения диагностики. Получение положительного результата ИФА и ПЦР — отрицательного, может быть вызвано использованием особых тест-систем в ИФАанализе, которые выявляют все виды бактерий, в том числе те, которые в определенном количеств в норме содержатся в организме человека. Тест-система, используемая в ПЦР-анализе, может быть основана только на определение особого вида болезнетворных бактерий. Например, тест-система для ИФАдиагностики настроена на выявление всех видов хламидий : С. Pneumonia, C. Pecorum, C. Psitaci. А в проведении ПЦР-анализа может быть использована тест-система, выявляющая только С. Trachomatis. Вот почему, ИФА-анализ на С. Pneumonia будет положительным, а ПЦР - отрицательным.

§ • Разница в используемом материале. Материал для ПЦР получают из места предполагаемой локализации инфекции. Для ИФА-диагностики разницы в месте нет, поскольку ИФА «реагирует» на антитела, которые вырабатываются при инфекционном процессе любой локализации. Как результат — ПЦР-диагностика дает отрицательный, а ИФА положительный результат. Например, хламидии могут локализироваться в разных местах организма. Вызвав хронический сальпингит , проведенный в области шейки матки анализ ПЦР хламидии не обнаружит. Но ИФА-диагностика все равно выявит выработку антител, сопровождающую инфекционный процесс. • Хронические инфекционные заболевания могут стать причиной разницы в результатах ИФА и ПЦР-диагностики. При этом зачастую ПЦР дает положительный, а ИФА — отрицательный результат. Уставшая от хронического инфекционного процесса иммунная система может «не показать» повышенный уровень антител к инфекции. Подобное может наблюдать врач-лаборант в том случае, если инфекция «свежая» , т. е. даже при наличии определенных симптомов уровень антител класса Ig. G в крови не превысит норму, поскольку они еще не начали вырабатываться. Для половых инфекций подобный период «молчания» ИФА-диагностики может достигать двух недель. Подводя итоги, можно сказать, что и ИФА, и ПЦР-анализы сами по себе не являются панацеей в диагностике инфекций. Нельзя одной ПЦР или ИФА-диагностикой заменить все существующие методы исследования, ими можно лишь дополнить их, позволив всем методам достигнуть реальных, точных, достоверных результатов.

Цитогенетическое обследование. § Показаниями к его проведению являются: подозрение на хромосомную болезнь; множественные врожденные пороки развития; несколько неблагополучных исходов беременности (спонтанные аборты, мертворождения, врожденные пороки развития у детей); нарушение репродуктивной функции; пренатальная диагностика. § Молекулярно-генетические методы позволяют диагностировать наследственную болезнь на уровне ДНК (гена). Все многочисленные варианты этих методов основываются на методах технологии рекомбинантной ДНК или генной инженерии.

§ Биохимические методы применяют при подозрении на наследственную болезнь обмена веществ. Они могут быть многоэтапными (“просеивающие программы”) или сразу строго направленными на определенную патологию. В биохимической диагностике используют все методы современной биохимии. § Иммуногенетическое обследование больного, его родственников позволяет выявить наследственные иммунодефициты, использовать данные для диагностики методом сцепления генов, оценить совместимость матери и плода, определить прогноз при болезнях с наследственным предрасположением. § Цитологические методы применяются в дифференциальной диагностике кожных болезней, болезней накопления (мукополисахаридозы, муколипидозы). § Метод сцепления генов рекомендуется в тех случаях, когда прямая диагностика невозможна. При этом решается вопрос, унаследовал ли пробанд мутантный ген, если в родословной имеется это заболевание. В основе метода лежит генетическая закономерность совместной передачи генов, локализованных в одной хромосоме (группе сцепления).

ПРИНЦИПЫ ЛЕЧЕНИЯ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ. § С учетом разнообразия типов мутаций, звеньев нарушенного обмена, вовлеченности органов и систем не может быть одинаковых методов лечения для разных форм наследственных болезней. В основе их лечения лежат применяемые и при других болезнях направления – симптоматическое, патогенетическое, этиологическое. Симптоматическое и патогенетическое направления предусматривают использование всех видов современного лечения: лекарственное, диетическое, хирургическое, рентгенорадиологическое, физиотерапевтическое. Полное выздоровление при наследственных болезнях пока невозможно, но лечение их – не такая безнадежная программа с терапевтической точки зрения, как это казалось раньше.

§ Симптоматическое лечение назначают практически при всех наследственных болезнях, а для многих форм оно является единственным. К тому же оно усиливает положительный эффект патогенетического лечения. Виды симптоматического лечения разнообразны – от лекарственных средств до хирургической коррекции. Патогенетическое лечение направлено на коррекцию звеньев нарушенного обмена веществ. Если ген не функционирует, необходимо возместить его продукт; если ген производит аномальный белок и образуются токсичные продукты, следует удалить их и возместить основную функцию гена; если ген производит много продукта, то избыток его удаляют.

Использованная литература Н. П. Дубинин. “Генетика и человек”. М. , ”Просвещение”, 1978. § М. Сингер , П. Берг. ” Гены и геномы”, . М. , 1998 § Ф. Айала , Дж. Кайгер. “Современная генетика” М. , 1988 § Е. Ф. Давиденкова, А. Б. Чухловин. “О наследственности”. М. , ”Медицина”, 1975.