ДНК — ЗОНДЫ Выполнила студентка 3 курса ФВМ

ДНК - ЗОНДЫ Выполнила студентка 3 курса ФВМ Новикова Мария

ДНК-зонд — одноцепочечная ДНК, длиной до 30 нуклеотидов, используемая для поиска комплементарных последовательностей в молекуле большего размера или среди множества разнообразных молекул ДНК-зонды можно синтезировать искусственно либо выделить из генома. Затем эти последовательности клонируют, чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неограниченном количестве.

Принцип метода: структуру двойной спирали ДНК (или РНК) можно разрушить нагреванием, при этом происходит разделение цепей – денатурация. Температуру, при которой происходит разделение цепей ДНК, называют точкой плавления. Этот процесс обратимый, происходит образование двойной спирали – ренатурация. Если при ренатурации взяты молекулы из разных источников – гибридизация.

Гибридизацию можно осуществять в растворе или на фильтре. Метод обладает высокой чувствительностью. Гибридизация ДНК-зонда с РНК, выделенной из анализируемой клетки, может выявить наличие или отсутствие экспрессии гена. Если гибридизации не происходит, значит ген молчит, не работает. ДНК-зонды также позволяют проводить диагностику наследственных болезней.

Блоттинг ДНК по Саузерну ü Исследуемую ДНК гидролизуют рестриктазами, фракционируют электрофорезом, переносят разделенные фрагменты на нитроцеллюлозный фильтр и проводят реакцию гибридизации с мечеными олигонуклеотидами. Этот метод был разработан Саузерном в 1975 году. В отечественной литературе его принято называть «южный блоттинг» . «Блоттинг» - в переводе с английского означает «промокашка» , «саузерн» - «южный» .

ü Молекулы ДНК разгоняют в агарозном геле электрофорезом. ДНК в геле денатурируют щелочью. Щелочь нейтрализуют и пластину геля покрывают листом нитроцеллюлозы. Сверху на нитроцеллюлозу помещают стопку листов фильтровальной бумаги, обеспечивая медленный ток буферного раствора через гель в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. ДНК диффундирует из геля и связывается с нитроцеллюлозным фильтром. После прогревания фильтра при 80 о. С в вакууме ДНК необратимо связывается с нитроцеллюлозой. Расположение полос иммобилизованной ДНК точно соответствует их расположению в геле.

ü ДНК, связанную с нитроцеллюлозным фильтром, можно гибридизовать с радиоактивно меченой ДНК. Блоттинг по Саузерну является исключительно полезным также и для локализации изучаемых генов в определенных фрагментах, полученных в результате гидролиза различными рестриктазами гибридных молекул ДНК, хромосомной ДНК и т. д.

Одним из наиболее точных и современных методов анализа является использование чипов. Они представляют собой пластинки с иммобилизованными меченными ДНК-зондами. Каждая такая пластинка может содержать несколько десятков тысяч зондов, расположенных в определенной последовательности. Метка проявляется только в спаренных двухцепочечных фрагментах. Если в исследуемом образце есть последовательности, комплементарные последовательностям зонда, то гибридизацию можно определить визуально или с помощью специальных приборов. Как правило, детекторы соединены с компьютером, то есть процедура считывания и обработки информации автоматизирована. Такие ДНК-чипы можно применять для комплексной диагностики инфекционных заболеваний, наследственных дефектов, установления экспрессии тех или иных генов (в этом случае идет гибридизация с м. РНК), то есть отслеживания нарушений обмена веществ. Они дешевы, очень надежны, просты в обращении и могут многократно использоваться. Недостаток – дорогая аппаратура для детекции.

В последние годы разрабатывается новый метод анализа ДНК – генная дактилоскопия. Она начала широко внедряться в практику судебномедицинской экспертизы только в последние годы. С помощью различных гистохимических тестов установлено, что в состав хромосом входят комплексы белка с дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК). В настоящее время анализ участков ДНК прочно вошел в практику судебно-биологических исследований для идентификации личности, установления родства, определения пола. Эти исследования возможны с минимальным количеством материала, даже частично разрушенным, и применимы для любых тканей, из которых можно выделить ДНК. Например, кровь, слюну, сперму, их пятна, а также волосы.