ДНК-МИКРОЧИПЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ МИКРОООРГАНИЗМОВ Рубцова

ДНК-МИКРОЧИПЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ МИКРОООРГАНИЗМОВ Рубцова М. Ю. , Уляшова М. М. , Халилова Ю. И. , Егоров А. М. Химический факультет МГУ имени М. В. Ломоносова ЗАО «НПП ИММУНОТЕХ»

· Проблема: Устойчивость микроорганизмов к действию бета-лактамных антибиотиков · Причина : Продукция бактериальных ферментов – бета-лактамаз

Бета-лактамазы представляют собой группу бактериальных ферментов, способных гидролизовать бета-лактамные антибиотики S S H 2 O HN N O COOH OH COOH 1940 – E. Abraham E. Chain описали инактивацию пенициллина в бесклеточном экстракте культуры E. coli 1965 – описана бета-лактамаза ТЕМ-1 Наст. время – описано более 700 бета-лактамаз

Классификация семейства бета-лактамаз TEM SHV CTX-M KPC OXA VIM IMP SPM GIM SIM • Бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) • Ингибитор-устойчивые бета-лактамазы • Карбапенемазы

Задача: одновременная идентифицикация нескольких типов бета-лактамаз, определение мутаций в них Возможное решение: • использование молекулярногенетических методов • использование мультипараметрических методов исследований 5

Биологические микрочипы – это организованное размещение биологически активных молекул в виде миниатюризированных матриц на специальном носителе Микрочип Метод ДНК-зондов 6

Особенности технологии микрочипов ü Одновременное определение множества параметров ü Миниатюризация ü Автоматизация ü Высокая производительность 7

Метод гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах Выделение ДНК • Амплификация гена (ПЦР) • Введение метки Гибридизация Детекция результатов гибридизации по активности метки

Детекция результатов гибридизационного анализа Микрочипы с флуоресцентной детекцией Cy 3 Микрочипы с колориметрической детекцией Фермент Бт Окрашенный продукт Субстрат 9

Идентификация типа гена C A U C G A G T A G C T Прямая цепь G U A G C U C A T C G A Обратная цепь 10

Выявление точечных мутаций в генах 151 TEM-1 . . . GSGHYGT. . . TEM-21 . . . GSGRYGT. . . TEM-1 CCGCTTTTTTGCACAACATGGGGG TEM-21 CCGCTTTTTTGCGCAACATGGGGG CCGCTTTTTTGCCCAACATGGGGG CCGCTTTTTTGCTCAACATGGGGG A G C T Анализ нуклеотидных последовательностей генов 11

ДНК-микрочип для идентификации генов БЛРС и ингибитор-устойчивых бета-лактамаз Носитель: найлон Размер чипа: 8 мм х 14 мм Диаметр точки: ~ 350 µm Количество точек: 246 Количество зондов: 78 Идентификация: • 3 типа генов βлактамаз: TEM, SHV и СТХ-М • 25 мутаций в них для определения БЛРС и ингибитор-уст. БЛ Контроль иммобилизации Отр. контроль гибр. Полож. контроль гибр. Идентификация типа гена Мутации в bla. TEM Мутации в bla. SHV Мутации в bla. СТХ-М

Интенсивность, отн. ед. TEM-1 + SHV-1 (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам I поколения) TEM-1 + SHV-12 + CTX-M-15 (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам I-IV пок. Интенсивность, отн. ед. ний) 13

Результаты тестирования штамма K. pneumonia, продуцирующего три β-лактамазы: TEM-1, SHV-1 и СTX-M-9 SHV-1 CTX-M-9 Интенсивность, отн. ед. TEM-1 14

Апробация ДНК-микрочипа на клинических штаммах Enterobacteriaceae (n=100) БЛРC – (n = 10): Не обн. ТЕМ-1 SHV-1 (TEM-1+ SHV-1) 20% 10% 50% БЛРС+ (n = 90): SHV-5 -like CTX-M-1 -like CTX-M-2 -like CTX-M-9 -like TEM-1 -like + SHV-2 -like TEM-1 -like + SHV-5 -like TEM-1 -like + CTX-M-1 -like TEM-1 -like + CTX-M-9 -like SHV-1 -like + SHV-5 -like SHV-1 -like + CTX-M-1 -like TEM-1 -like + SHV-2 -like TEM-1 -like + SHV-5 -like TEM-1 -like + SHV-1 -like + CTX-M-1 -like TEM-1 -like + SHV-1 -like + CTX-M-9 -like SHV-2 -like + CTX-M-1 -like SHV-5 -like + CTX-M-9 -like TEM-1 -like + SHV-2 -like + CTX-M-1 -like TEM-1 -like + SHV-2 -like + CTX-M-2 -like TEM-1 -like + SHV-5 -like + CTX-M-1 -like TEM-1 -like + SHV-5 -like + CTX-M-9 -like SHV-1 -like + SHV-2 -like + CTX-M-1 -like SHV-1 -like + SHV-5 -like + CTX-M-9 -like TEM-1 -like + SHV-2 -like + CTX-M-1 -like TEM-1 -like + SHV-2 -like + CTX-M-9 -like TEM-1 -like + SHV-5 -like + CTX-M-1 -like TEM-1 -like + SHV-5 -like + CTX-M-2 -like 24, 6% штаммов продуцировали 2 БЛРС

ДНК-микрочип для определения генов карбапенемаз Id_IMP VIM-1 OXA-23 IMP-2 VIM-2 OXA-40 IMP-5 VIM-7 OXA-51 IMP-11 Идентификация карбапенемаз: VIM, IMP, SPM, GIM, SIM (класс B) OXA ( класс D) KPC (класс A) Id_OXA IMP-1 Носитель: найлон Размер микрочипа: 11 мм× 15 мм Диаметр одной точки: 350 мкм Количество точек: 132 Id_VIM Id_SPM OXA-58 IMP-14 Id_SIM Id_KPC Id_GIM Контроль иммобилизации Положительный контроль гибридизации Отрицательный контроль гибридизации Идентификация для металло-β-лактамаз Идентификация OXA-β-лактамаз Идентификация KPC-β-лактамаз

Апробация ДНК-микрочипа для определения генов карбапенемаз на клинических штаммах Типы обнаруженных карбапенемаз Микроорганизм Число штаммов OXA-23 like OXA-40 like OXA-51 like OXA-58 like VIM-2 like Acinetobacter baumanii n=15 1 5 15 4 - Pseudomonas aeruginosa n=15 - - 11

Интегрированный ДНК-микрочип для идентификации β-лактамаз Скрининг клинических образцов на наличие БЛРС, ингибитор-устойчивых бета-лактамаз класса А и карбапенемаз классов A, B, D

Благодарности: 1. Химический факультет МГУ имени М. В. Ломоносова 2. 3. 4. 5. Уляшова М. М. Халилова Ю. И. Григоренко В. Г. Игнатенко О. В. 6. НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленская гос. мед. академия 7. Эдельштейн М. В. 8. Институт нейрохирургии им. Н. Н. Бурденко 9. Александрова И. А. Финансовая поддержка: ФЦП "Национальная технологическая база" на 2007 -2011 годы (Контракт ГП/07/442/НТБ/К)

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !