Диагностика наследственной патологии Молекулярно-генетические методы диагностики Кафедра факультетской

Диагностика наследственной патологии. Молекулярно-генетические методы диагностики. Кафедра факультетской терапии

Медицинская генетика. Что это? ► Медицинская генетика изучает механизмы наследственной предрасположенности и врожденной резистентности к заболеваниям с наследственной предрасположенностью, генетические аспекты иммунитета, аллергии, трансплантологии канцерогенеза, разрабатывает методы диагностики, лечения и профилактики наследственных болезней человека ► Медицинская генетика изучает роль наследственности в патологии человека, закономерности передачи из поколения в поколение наследственных болезней, разрабатывает методы диагностики, лечения и профилактики наследственной патологии, включая болезни с наследственной предрасположенностью.

Этапы становления медицинской генетики как науки Преподавание МГ в медицинских ВУЗах России началось в конце 70 -х г. Л. О. Бадалян на кафедре нервных болезней пед. факультета впервые прочитал лекции по МГ. ► В середине 70 -х г. классические направления генетики пополнились новым направлением – обратная генетика или генетика позиционного клонирования (выделение, клонирование, изучение структуры генов без предварительного знания их белковой структуры). ► В современной МГ широко применяются цитогенетический и молекулярно-генетический анализ семей с наследственной патологией, а также картирование генов. ►

К терминологии 1. Картирование генов – определение взаимного расположения генов в молекуле ДНК, а также расстояния между генами 2. Секвенирование – определение порядка расположения оснований – нуклеотидов в молекуле ДНК и РНК 3. или определение порядка аминокислот в белке

Точные методы генетики позволяют: ► широко диагностировать наследственную патологию ► установить широкую гетерогенность многих наследственных болезней ► выявить взаимосвязь между причинными генными мутациями и выраженностью клинических проявлений ► определить последовательность нуклеотидов в сотнях генов наследственных болезней -› точная диагностика, в том числе пренатальная.

Ближайшее будущее МГ (практические аспекты) ► Увеличение в несколько раз количества МГконсультаций ► Специалисты по медицинской генетике будут включаться в клиническое ведение многих больных и семей ► Резко увеличится доля медицинской генетики в образовании врачей почти всех специальностей ► Внедрение достижений медицинской генетики в работу первичного звена (врачи общей практики и т. п. ) ► Появление должностей МГ- консультанта для взрослых и для детей ► Вакцины от СПИДа, малярии и туберкулеза

Семиотика наследственных болезней ► Семиотика – это учение о знаках. ► Семиотика наследственных болезней- это учение о знаках (симптомах) болезней, правильном обозначении их круга, морфологических и функциональных изменениях органов и частей тела, динамике клинических проявлений, т. е. это необходимое условие для успешной диагностики заболевания.

Синдромологический метод ► Выявление предметно-образных знаков , т. е. главных признаков врожденного или наследственного заболевания (синдрома).

Синдромологический подход (метод) ► Основан на общем клиническом методе обследования больных. ► Методика обследования: 1. Сбор и анализ детальных данных анамнеза жизни и анамнеза заболевания ↓ ► Сбор и анализ детальных данных объективного обследования больного и его родственников, в том числе спец. и доп. методы исследования

Цели детального сбора анамнезаполучение сведений ► ► ► О сибсах, родителях и др. родственниках 1 -2 степени родства О предыдущих беременностях и родах, периодах новорожденности, вскармливания, раннего развития больного ребенка Об отягощенном течении данной беременности (прием лекарств, воздействие тератогенных и мутагенных факторов на эмбрион и плод, наличие у супругов вредных привычек и проф. вредностей) Об отягощенном акушерском анамнезе (токсикозы, угрозы выкидыша, много- и маловодия, преждевременных родов, случаев мертворождения или рождения детей с задержкой развития, пренатальной гипотрофией, пороками развития, хромосомными синдромами, моногенными и мультифакториальными заболеваниями) Об отягощенном гинекологическом анамнезе (ЗПП, хронические неинфекционные заболевания).

Цель объективного обследования ► Поиск предметно-образных знаков Примеры: ► лицо эльфа (с-м Вильямса) ► птицеголовая карликовость (с-м Секкеля) ► кошачий крик (с-м делеции короткого плеча хромосомы 5) ► кошачий глаз (с-м Шмида-Фраккаро) ► глаза лани (с-м частичной моносомии по длинному плечу хромосомы 22) и т. д.

Классификация признаков наследственного заболевания: Главные (основные или специфические) - патогномоничные (низкий рост при наследственных формах карликовости) - ведущие признаки (атаксия и телеангиэктазии при синдроме Луи-Бар - типичные признаки (сколиоз при наследственных заболеваниях соединительной ткани) ► ► Неглавные (второстепенные или неспецифические) Пример, клинодактилия мизинца – норма и с-м Рассела. Сильвера

Детально оценить! ► ► ► ► Весо-ростовые показатели; Костный возраст; Тип телосложения, наличие асимметрии, пропорциональность строения скелета, головы, туловища, конечностей; Состояние кожи, ПЖК и слизистых оболочек, нарушение пигментации, состояние оволосения, рост волос и ногтей; Размеры, форма и наличие аномалий развития черепа, глаз и ушных раковин, лица, носа, рта, губ, верхней и нижней челюсти и зубов; Размеры и форма шеи; Размеры и форма грудной клетки, состояние грудины, ключиц, лопаток, ребер; Наличие грыж белой линии живота, пупочных и паховых грыж; Состояние мышц передней брюшной стенки; Форма, длина конечностей; Степень подвижности суставов; Состояние мышечного тонуса; Состояние внутренних органов, эндокринных желез и гениталий; Состояние и варианты задержки психомоторного, физического, психического, речевого и полового развития; Наличие неврологической симптоматики, офтальмологических изменений, нарушений слуха, обоняния и т. д. ; Цвет и запах мочи и/или запах тела.

Особенности наследственного заболевания: ► Манифестация (возраст больного, на который приходится появление первых признаков; ► Прогредиентный характер течения; ► Множественность (полисистемность поражения); ► Сегрегация заболевания и/или его симптомов в семьях; ► Резистентность к терапии

Классические методы медицинской генетики ► Клинико-генеалогический (Типы наследования и т. п. ) ► Близнецовый метод ► Популяционно-статистический (Hbs) ► Биохимический метод ► Метод рекомбинатной ДНК ► И т. д.

Близнецовый метод ► Формула Хольцингера: Н=КМБ(%)-КДБ(%)/100%-КМБ(%), Где Н-доля наследственности, КМБ- конкордантность монозиготных близнецов КДБ- конкордантность дизиготных близнецов

Популяционно-статистический метод ► Закон Харди-Вейнберга р2+2 рq+q 2=1(100%) р- частота встречаемости доминантного гена, q - частота встречаемости рецессивного гена р2 - частота доминантных гомозигот, q 2 - частота рецессивных гомозигот 2 рq –частота гетерозигот

Специальные методы МГ ►Цитогенетический ►Биохимический ►Иммунологический ►Молекулярно-генетический

Дополнительные методы МГ: ► УЗИ внутренних органов ► Рентгенография ► Магнитно-резонасная томография ► Электромиография ► Электрокардиография и др.

Клинико-генеалогический метод Наиболее старый метод МГ ► Суть - сочетание общего клинического и генеалогического методов (составление и анализ родословных) с целью выявления и изучения врожденного или наследственного заболевания у пробанда, его больных или здоровых родственников. ► § Возможности: 1. Определить наследственный или ненаследственный характер заболевания; тип наследования; 2. Принадлежность гена к этой ли иной группе сцепления генов (хромосоме) (моногенный тип) 3. Распространение гена в популяции

Генеалогический метод

Классификация болезней Болезни семейные: ► Врожденная патология: наследственные болезни, не связанные с наследственной патологией Классификация наследственной патологии. ► Генные (Моногенные, Полигенные) ► Хромосомные аберрации (Полисомии, трисомии, моносомии, транслокации)

Цитогенетический метод ► Субъекты: пробанд, его родители, или плод при подозрении на хромосомный синдром или хромосомное нарушение. ► Клиническая цитогенетика позволяет: § установить происхождение структурно перестроенных хромосом и их точную локализацию; § выделить синдромы, обусловленные дисбалансом по участкам индивидуальных хромосом; § накапливать сведения об изменениях хромосом в опухолевых клетках, клетках больных с наследственными заболеваниями крови и др.

Объекты цитогенетического метода ► культуры лимфоцитов периферической крови, фибробласты кожи и т. д. ► Возможности: идентификация кариотипа (количество и морфологические особенности индивидуальных хромосом набора). ► Методики: - анафазный и телофазный анализ - метафазный анализ - современный!!! – прометафазный анализ

ЭТАПЫ ИССЛЕДОВАНИЯ (метафазный анализ) 1. культивирование клеток человека (чаще лимфоцитов) на искусственных питательных средах; 2. стимуляция митозов фитогемагглютинином (ФГА); 3. добавление колхицина (разрушает нити веретена деления) для остановки митоза на стадии метафазы; 4. обработка клеток гипотоническим раствором, вследствие чего хромосомы «рассыпаются» и лежат свободно; 5. простое и дифференциальное окрашивание хромосом; 6. изучение хромосом под микроскопом и фотографирование; 7. вырезание отдельных хромосом и построение идиограммы.

Цитогенетический метод ► Прометафазный анализ - диагностика микрохромосомных синдромов (этиология – микроделеции, микродупликации, парацентрические инверсии): § § § § § С-м Ангельмана Видемана-Беквита Гарднера Ди-Джорджа «кошачьего глаза» Миодистрофии Дюшена и Бекера Нейрофиброматоз 1 и 2 типа Холт-Орама (всего 20 нозологических единиц), а также неоплазии

Цитогенетический метод Основные показания для проведения цитогенетического исследования ► ► ► Подозрения на хромосомную болезнь (определенная клиника) подтверждение диагноза. Наличие множественных врожденных пороков не относящихся к генному синдрому Многократные спонтанные аборты, мертворожденные, дети с врожденными пороками (показание для матери) Нарушение репродуктивной функции неясного генеза Существенная задержка умственного и физического развития у ребенка Пренатальная диагностика (возраст, транслокации у родителей, предыдущий ребенок с хромосомной болезнью). Подозрение на синдромы, характеризующиеся хромосомной нестабильностью (учет хромосомных и СХО) ► Лейкозы (диф. диагностика, оценка эффективности лечения, прогноз) ► Оценка мутагенных воздействий (радиационных, химических). ►

Что тут можно увидеть?

Хромосомный набор больного с синдромом Дауна

Иммунологические методы ► Показания: § наследственные иммунодефицитные состояния (дис- и агаммаглобулинемия, атаксия-телеангиэктазия) § антигенная несовместимость матери и плода § установление отцовства § генетические маркеры при анализе сцепления генов и определении предрасположенности к болезням (гены с выраженными фенотипическими проявлениями) ► Методики: анализ гамма-глобулинов, Т- и Влимфоцитов, содержание комплемента в крови, функции фагоцитарных клеток, определение HLAантигенов в лейкоцитах крови.

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ МЕДИЦИНСКОЙ ГЕНЕТИКИ ► ВЫЯВЛЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКОГО ФЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА Уровни оценки фенотипа ► Первичный продукт гена - полипептидная цепь ► Фермент (диагностика энзимопатий) ► Конечные метаболиты (специфичные для заболевания).

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ► СХЕМА ОБСЛЕДОВАНИЯ КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА ГЕНЕАЛОГИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКАЯ СТРАТЕГИЯ ► Просеивающий метод - поэтапное исключение определенного класса болезней Этапы ► ► ► 1. Первичный Выявление здоровых и отбор пациентов для уточнения диагноза программы, используется чаще уровень 3 а)массовые (скрининг) фенилкетонурия, врожденный гипотиреоз, адреногенитальный синдром, б-нь Дауна. . б) селективные (у “подозрительных”) болезни обмена, гемоглобинопатии и т. п. 2. Уточняющий используются уровни 1 -2 -3. Недостаточность -антитрипсина, недостаточность Г-6 -ФД, гепатолентикулярная дегенерация и т. п. биохимические методы ? молекулярно-генетические ? молекулярно-биологические

Экспресс-методы ► Быстрые предварительные методы изучения генетики человека (применяются как скрининг-методы, при проведении просеивающих программ) Примеры: Скрининг новорожденных на фенилкетонурию, гипотиреоз беременных на α-фетопротеин (анэнцефалия, открытые формы спинномозговых грыж, синдром Дауна) Требования: -диагностическая значимость -надежность -использование легкодоступного материала в малых количествах -приемлемость для обследуемых, исполнителей и врачей -экономичность

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Нагрузочный метод Цель: ► § 1) выявить гетерозиготных носителей патологических генов; § 2) предрасположенность к сахарному диабету, гипертонии и др. Пример: фенилкетонурия. в/в введение фенилаланина с определением его концентрации через равные промежутки времени У АА – быстрое возвращение концентрации к исходной. У Аа – медленное восстановление исходной концентрации.

Методы аналитической биохимии исследование метаболического пути (количественное определение метаболитов, их кинетики и накопления); ► прямое измерение концентрации (иммунохимические методы), активности (энзимодиагностика), физикохимических и кинетических параметров мутантных белков; ► исследование мутантных белков с помощью нагрузочных проб меченными субстратами и гибридизации соматических клеток; ► исследование структуры мутантного гена методами рестриктивного анализа. ►

Молекулярно-цитогенетический и молекулярно-биологические методы это методы исследования молекулярной структуры ДНК (основные дифференциальнодиагностические тесты)

Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) ► 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) Этапы: Готовят однонитевой участок ДНК для исследуемой хромосомы или ее участка; Присоединяют к нему биотин и дигоксигенин ( «помеченный» участок ДНК – зонд); На микропрепарате in situ денатурируют хромосомную ДНК от больного щелочной обработкой; Препарат обрабатывают зондом; Комплементарность зонда и участка ДНК – соединение (ренатурация участка ДНК); Обработка препарата стрептовидином и антигоксигениновым АТ; Обработка флюоресцетными красителями (родамин-красный или флюоресцент-зеленый); Люминисцентная микроскопия. Показания: локализация генов в хромосомах, все хромосомные аберрации, диагностика анеуплоидий в интерфазных ядрах

Новый метод исследования – комбинация метода молекулярной генетики и цитогенетики. Метод FISH – флюоресцентная гибридизация.

Молекулярно-генетические методы – предназначены для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований.

Этапы молекулярно-генетических методов ►Исходный этап - получение образцов ДНК или РНК а) выделение всей ДНК; б) накопление определенных фрагментов с помощью ПЦР.

МЕТОДЫ : ►ПРЯМЫЕ Известна нуклеотидная последовательность полимеразной ДНК, есть информация о природе, частоте и локализации мутаций, о “горячих точках”. КОСВЕННЫЕ Болезни с неописанными мутациями, либо не найдено мажорных мутаций. Используются сцепленные с геном полиморфные маркеры

Методики ► Определение нуклеиновых последовательностей (секвенирование) генов ► Прямая детекция мутантных генов ► Генетический анализ полиморфизма ДНК родителей и ребенка ► Определение первичного продукта гена

Этапы молекулярно-генетических методов ► Метод клонирования ДНК – изолирование гена и создание его копий (разрезание рестриктазами на фрагменты и амплификация ДНК в условиях in vitro) ► транскрибирование и транслирование гена ► Метод гибридизации нуклеиновых кислот -электрофорез на агарозном геле – разделение фрагментов, -идентификация фрагментов (метод блотгибридизации по Саузерну)

Методика блот-гибридизации по Саузерну 1) после электрофореза гели помещают в щелочной раствор для денатурации фрагментов ДНК, 2) одноцепочечные ДНК вымывают из геля на нейлоновые фильтры током буфера и фиксируют одноцепочечные ДНК на фильтре 3) для визуализации нужных фрагментов проводят гибридизацию исследуемого образца со специфическим по нуклеотидной последовательности меченным радиоактивно или флюоресцентной меткой олигонуклеотидным зондом 4) экспонирование фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография) либо использование люминисцентного микроскопа для флюорометок

Диагностируемые болезни ► Гемофилии, тромбофилии, гемоглобинопатии, ► митохондриальные болезни ► Муковисцидоз, фенилкетонурия, миопатия Дюшена Около 300 наследственных болезней ► Миопатия Дюшена, ► болезни накопления

Микрочипы ► Principle: Similar to electronic chips, all possible variants of the DNA strand under investigation can be placed on the surface of a silicon chip (see Fig. 14). The DNA under investigation is replicated by PCR (polymerase chain reaction) and at the same time labelled by fluorescent substances which are incorporated in the DNA. When the DNA under investigation and the chip DNA coincide, a positive reaction is produced under ultraviolet radiation. Samples can be taken from finger prints, hair or drops of blood. In this way it is now possible to automatically analyse 20, 000 to 30, 000 genetic properties on 1 cm 2.

Микрочипы

Микрочипы

Пренатальная диагностика ► Позволяет решить биологические и этические проблемы до рождения ребенка, предупредить рождение ребенка с патологией, не поддающейся лечению (путем прерывания беременности с согласия женщины) Возможности пренатальной диагностики: 1. все хромосомные болезни (любой срок беременности) 2. врожденные пороки развития (после 12 недель, либо во 2 -ой половине беременности) 3. Энзимопатии

Показания для пренатальной диагностики ► ► ► ► ► Наличие в семье точно установленного наследственного заболевания Возраст матери старше 37 лет Носительство матерью Х-сцепленного рецессивного заболевания Наличие в анамнезе у беременных спонтанных абортов в ранние сроки беременности Мертворождения неясного генеза Детей с множественными пороками развития и хромосомной патологией Наличие структурных перестроек хромосом (транслокаций и инверсий) у одного из родителей Гетерозиготность обоих родителей по одной паре аллелей при патологии с АР типом наследования Беременные из зоны повышенного радиационного фона

Методы пренатальной диагностики 1. Непрямые (обследуют беременную): акушерско-гинекологические методы, сыворотка крови на α-фетопротеин) 2. Прямые (обследуют плод) а)неинвазивные (ультрасонография) б) инвазивные (хорионбиопсия, амниоцентез, кордоцентез, фетоскопия)

Ультросонография► Это использование ультразвука для получения изображения плода и его оболочек, состояния плаценты Возможности диагностики (на 12 -20 -й нед. беременности): -близнецовая беременность, -локализация плаценты, -анэнцефалия, гидроцефалия -дефекты костной системы, и закрытия невральной трубки -атрезии ЖКТ, -поликистоз и агенезия почек, -гипоплазия легких, -МВПР, пороки сердца -водянка плода и плаценты.

Концентрация α-фетопротеина Используется в диагностике (в 1 триместре беременности ): -МВПР, -спинномозговая грыжа, -гидроцефалия, анэнцефалия, -пороки развития ЖКТ, -дефекты передней брюшной стенки, -гидронефроз, агенезия почек, -задержка внутриутробного развития плода, -многоплодная беременность, -преэклампсия, -резус-конфликт, -вирусный гепатит В ►

Хорионобиопсия ► исследование эпителия ворсин хориона (8 -10 недели гестации) ► проводится трансцервикально или трансабдоминально под контролем УЗИ ► диагностируются генные, геномные и хромосомные мутации

Амниоцентез ► Получение амниотической жидкости и клеток плода для анализа (16 нед. беременности) Основные показания: -возраст беременной старше 35 лет, -превышение пороговых значений уровней α-фетопротеина, ХГ -несколько серьезных факторов риска осложнений беременности Отдельные показания -мертворождения, пренатальная смертность в акушерском анамнезе, -рождение ребенка с хромосомными болезнями -хромосомный сбалансированный мозаицизм у родителей -синдром ломкой Х-хромосомы -определение пола плода при риске наследственных Х-сцепленных заболеваний -диагностика наследственных энзимопатий, -воздействие тератогенных агентов в критические периоды эмбриогенеза, -риск внутриутробных инфекций (краснуха, цитомегалия, токсоплазмоз) и др.

Кордоцентез ► Взятие крови из пуповины, клетки и сыворотка которой используется для специальных исследований 18 -22 нед. беременности) ► Преимущества перед амниоцентезом ► Показания те же

Современные методы ПД ► Биопсия кожи, мышц, печени плода ► Везикоцентез ► Доимплантационная диагностика (с-м Тея -Сакса, гемофилия, миодистрофия Дюшена, фрагильная Х-хромосома и т. д. ) ► Выделение клеток плода (эритробластов, трофобластов) из крови беременной для проведения цитогенетических, М-Г, иммунологических анализов

Этапы МГК ► Уточнение диагноза заболевания. (использование генетических методов) ► Определение прогноза потомства Установление генетического риска Определение тяжести медицинских и социальных последствий предполагаемой аномалии Перспектива применения и эффектность пренатальной диагностики. ► Составление заключения и советы пациентам.

Генетический риск – вероятность возникновения (от 0 до 100%) определенной патологии (аномалии) у самого пациента или его родственников.

Степени генетического риска: ► <05% низкий ► <10% повышенный в легкой степени ► <20% повышенный в средней степени ► >20%

Способы определения риска ► Теоретические расчеты, основанные на генетических закономерностях (моногенные болезни) ► Использование эмпирических данных: таблицы эмпирического риска, модели полигенного наследования и т. п. (мультифактериальные заболевания, врожденные пороки, хромосомные аберрации и т. п. ) ► Сочетание 1 и 2.

Спасибо за внимание