ДЕНЬ ОТКРЫТЫХ ДВЕРЕЙ ФБУН НИИ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

ДЕНЬ ОТКРЫТЫХ ДВЕРЕЙ ФБУН НИИ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ ПАСТЕРА n состоится 17 апреля 2013 года в 16 -00 n в Актовом Зале института. n научная деятельность в различных областях медицинской и биологической наук (микробиология, вирусология, эпидемиология, генетика, иммунология и др. ) и может предоставить возможность выполнения курсовых, бакалаврских и магистерских работ. В институте имеется отдел аспирантуры. n Приглашаем всех желающих познакомиться с научными направлениями работ ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера. n В программе: n - презентации по направлениям научной работы лабораторий института; n - ответы на вопросы n

Возбудители анаэробных инфекций СПб. ГУ 2013

План лекции n 1. Особенности анаэробных инфекций n 2. Отличие анаэробных и аэробных МО n 3. Классификация МО по степени толерантности к О 2 n 4. Клинически значимые анаэробные МО n 5. Характеристика Рода Clostridium n 6. Возбудители газовой гангрены n 7. Вид C. perfringens n 8. Вид C. botulinum n 9. Ботулотоксин n 10. Вид Clostridium tetani

Газовая гангрена - некроз мягких тканей

Вопрос 1. Особенности анаэробных инфекций n Анаэробная инфекция – это эндогенная и экзогенная инфекция, обусловленная развитием анаэробных микроорганизмов

Разновидности анаэробных инфекций n Экзогенная (раневая) анаэробная инфекция развивается при попадании в макроорганизм при травмах и ожогах анаэробных споровых микроорганизмов из внешней среды. n Эндогенная анаэробная инфекция возникает в результате проявления патогенных свойств анаэробными микроорганизмами, входящими в состав нормальной микрофлоры человека.

Вопрос 2. Отличие анаэробных и аэробных МО n Анаэробы: n 1. чувствительны к действию активных форм кислорода n 2. погибают в присутствии свободных радикалов кислорода n 3. нет ферментов цитохромной цепи (супероксиддисмутазы (СОД), каталазы) n 4. могут использовать в качестве питательных субстратов органические вещества (углеводы и белки), но в отсутствие кислорода n 5. брожение или бескислородный тип дыхания

Ферменты цитохромной цепи (СОД, каталаза) 2 О 2 - +Н 2 СОД Н 2 О 2 + О 2 ↑ 2 Н 2 О 2 каталаза 2 Н 2 О+О 2↑

Типы брожения и бескислородного дыхания n Брожение: n 1. маслянокислое, n 2. молочнокислое, n 3. пропионовокислое и др. ; n Бескислородный тип дыхания: n 1. сульфатный n 2. нитратный n акцептором ĕ служит не О 2 (как в случае кислородного дыхания), а сульфаты или нитраты.

Вопрос 3. Классификация анаэробов по степени толерантности к О 2 n 1. Строгие (облигатные) анаэробы – погибают в течение 1 мин при наличии в среде свободных радикалов О 2. Не растут, если среда содержит 0, 5% О 2 (метановые бактерии). n 2. Аэротолерантные микроорганизмы – выдерживают 1 час при концентрации О 2 0, 1% (Clostridium perfringens).

Классификация анаэробов по степени толерантности к О 2 n 3. Умеренные анаэробы или микроаэрофилы. Выживают при содержании О 2 2 -8%, когда О 2 меньше, а СО 2 больше - n 5 -10%. (р. Brucella). n 4. Факультативные анаэробы – растут в присутствии О 2 и без него. Для устранения свободных радикалов О 2 включают систему цитохромной цепи, образуется каталаза и СОД (все энтеробактерии). n 5. Аэробы – только кислородное дыхание (Bacillus, Leptospira).

Вопрос 4. Анаэробные микроорганизмы, имеющие клиническое значение Бактерии Анатомическое Споры расположение Гр (-) палочки Bacteroides Толстый кишечник - fragilis Bacteroides Ротовая полость - melaninogenicus Fusobacterium Толстый кишечник, - ротовая полость

Гр (+) палочки Actinomyces Ротовая полость - Lactobacillus Толстый кишечник, - вагина Bifidobacterium Толстый кишечник - Propionibacterium Кожа - Eubacterium Ротовая полость, - толстый кишечник Arachnia Ротовая полость, - толстый кишечник Clostridium Ротовая полость, + толстый кишечник, вагина

Анаэробные микроорганизмы, имеющие клиническое значение Гр (-) кокки Veillonella Ротовая полость, - толстый кишечник

Анаэробные микроорганизмы, имеющие клиническое значение Гр (+) кокки Peptococcus Ротовая полость, - толстый кишечник Peptostreptococcus Ротовая полость, - толстый кишечник

Вопрос 5. Характеристика Род Clostridium n Заболевания: газовая гангрена, столбняк, ботулизм, псевдомембранозный энтероколит, некротический энтерит n Нормальная микрофлора: ротовая полость, ЖКТ, вагина n Выделяют: 30 видов при ранениях, ожогах, ампутациях и операциях

Род Clostridium (150 видов) n C. perfringens – выявляют в 80% случаев n C. tetani n C. botulinum n C. septicum n C. sordellii n C. novyi n C. difficile

Смешанные анаэробные инфекции n ПОЛИКУЛЬТУРЫ: n Смесь клостридий разных видов n Клостридии и неспорообразующие анаэробы n неспорообразующие анаэробы и факультативные анаэробы

Морфологические свойства клеток р. Clostridium n Крупные Гр+ палочки n Ширина 0, 6 -0, 9 мкм n Длина 4 -9 мкм n Образуют эндоспоры при глубоком анаэробиозе n Все клостридии подвижны, n кроме n C. perfringens (нет n жгутиков)

Локализация спор р. Clostridium n А -- C. tetani ( «барабанные палочки» ) Б -- C. perfringens (различная локализация) B -- C. botulinum ("теннисные ракетки")

Культуральные свойства р. Clostridium Питательные среды: 1. Кровяной анаэробный агар с глюкозой 2. Среда Кита-Тароцци 1. Clostridium perfringens 2. Clostridium sporogenes 3. Контроль (незасеянная 1 2 3 среда) Среда Кита – Тароцци. Признаки роста - помутнение и газообразование. Показатели протеолиза - почернение и распад кусочков мяса

Культуральные свойства р. Clostridium 1. Незасеянная среда 2. Clostridium perfringens 3. Clostridium sporogenes 1 2 3 Среда для культивирования сульфитредуцирующих клостридий. Дифференциация происходит на основании способности редуцировать сульфит до сульфида, который с ионами железа образует черный преципитат.

Вопрос 6. Возбудители газовой гангрены n Газовая гангрена развивается при попадании спор Clostridium в некротизирующуюся ткань. n Окислительно-восстановительный потенциал этой ткани имеет отрицательный заряд.

Окислительно-восстановительный потенциал (Eh) n Eh некротизирующейся ткани -160 -180 m. V (микровольт) n Eh нормальной ткани +150 m. V n Редукторы кислорода (тиогликолевая кислота, хлористый цистеин, аскорбиновая кислота) снижают Eh до -100 m. V n Краситель-индикатор ризорцин обесцвечивается при Eh -60 m. V

Культивирование анаэробов в микроанаэростатах Контейнер для чашек Петри микроанаэростат

Патогенез газовой гангрены n Развивитие спор Clostridium в некротизирующейся ткани n 1. Отрицательные значения Eh n 2. Ферментация углеводов n 3. Образование: газы, некротизирующий токсин, гиалуронидаза, ДНК-аза, протеиназы n 4. Расширение зоны некроза → токсинемия →летальный исход n 5. Больного может спасти только специфическая антитоксическая сыворотка!!!

Клинические проявления клостридиальной инфекции n 1. некроз ткани n 2. токсинемия n 3. кишечные инфекции n 4. пищевые отравления n 5. некротический энтерит n 6. целлюлит n 7. воспаление оболочек мышечных тканей и сосудов n 8. колонизация сердечной мышцы, клапанов → эндокардит

Вопрос 7. Вид C. perfringens Морфологические свойства n Длина клеток до 8 мкм n Клетки образуют нити до 140 мкм n Образуют субтерминальные овальные эндоспоры на щелочных средах с белками n Неподвижны!!!!!!!

Культуральные свойства C. perfringens n Опт. Тº 35 -37ºС n р. Н 7, 2 -7, 4 n Через 2 -4 ч в ЖПС бурное газообразование и токсинообразование n Колонии 2 -5 мм с зоной n гемолиза

Культуральные свойства C. perfringens R-форма колоний

Биохимические свойства C. perfringens n 1. ферментируют все сахара с образованием кислоты и газа n 2. пептонизируют молоко n 3. слабая протеолитическая активность n (разжижают желатину) n 4. растут на 20% желчи и на 2% Na. Cl, n 5. не растут на 6, 5% Na. Cl

АГ свойства, патогенность и токсинообразование C. perfringens n Образуют множество экзотоксинов: n 1 - главные токсины n 2 - минорные токсины n Токсины обладают АГ- специфичностью

5 серотипов C. perfringens на основании АГ- специфичности токсинов Главные экзотоксины Серотипы C. perfringens α (альфа) β (бетта) ε (эпсилон) ι (йота) Фосфолип летальны Прототокси протото аза С й н ксин факто р А + – – В + + – С + – – D + – + – E + – +

Минорные токсины: n γ – Т 1 (гамма) – летальный фактор, n δ – Т 2 (дельта) – летальный фактор и гемолитические свойства, n η – Т 3 (эта) – летальный фактор, n θ – Т 4 (тэта) – гемолизин, n κ – Т 5 (каппа) – коллагеназа, летальный, некротический фактор, действие усиливается в присутствии цистеина, n λ – Т 6 (лямбда) – желатиназа, протеиназа, подавляется цистеином, n μ - Т 7 (мю) – гиалуронидаза, n ν – Т 8 (ню) – дезоксирибонуклеаза (разрушает ДНК)

Диагностика клостридий n Экспресс-диагностика через 2 ч: n 1. световая микроскопия: n мазки красят по Граму и определяют подвижность (препарат висячей капли). n Обнаружение большого количества Гр(+) крупных бактерий с обрубленными концами с субтерминальными спорами в совокупности с другими клиническими симптомами дает основание предполагать, что инфекция вызвана бактериями клостридиальной этиологии. n 2. ИФА на токсины с сыворотками

Чувствительность клостридий к АМП n Левомицетин n Метронидазол n Клиндамицин n Обязательно проверить на чувствительность к АМП – культивирование проводят в микроанаэростате (37 о. С, 4 часа при 1 атм).

Вопрос 8. Вид C. botulinum n Ботулизм – тяжелая токсикоинфекция, характеризующаяся специфическими параличами n 1896 г. n botulus (лат. ) - колбаса

Клетка C. botulinum (позитивное окрашивание, ТЭМ) Жгутики

Морфологические свойства C. botulinum n клетки Гр+ с закругленными концами, длина 4 -9 мкм, образуют субтерминальные и терминальные споры – теннисная ракетка n Жгутики !!!!

Антигенные свойства C. botulinum n 8 серотипов (деление основано на различии свойств токсинов): n A – наибольшее значение в США n B – наибольшее значение во Франции n C 1 n C 2 n D n E – наибольшее значение в Японии n F – нет в России n G

Среда обитания C. botulinum n Постоянно споры в воде, почве → фрукты, овощи → кишечник человека и животных → с испражнениями в окружающую среду → состояние споры n Нормальная микрофлора ЖКТ животных и рыб n Споры обнаруживают в 9% проб почвы n и 4% проб воды

Культуральные свойства C. botulinum - строгие анаэробы n Оптимальная температура роста: n Для серотипов A, B, C, D - 34 -35 ºC n Для серотипов E, F - 26 -30 ºC n Токсины частично разрушаются при +80 ºC

Устойчивость спор C. botulinum n Споры серотипов А, В, F- наиболее устойчивы, разрушаются при кипячении 5 -6 ч n Хорошо переносят температуру – 16 о. С в течение года, могут прорасти и образовать токсины. n Продукты, обсеменение большим числом спор, после размораживания могут оказаться токсичными.

Биохимические свойства C. botulinum n 1. Ферментация сахаров – непостоянный признак n 2. В диагностике исследуют протеолитические свойства: n Серотип А, часть В и F – обладает сильным протеолитическим действием, остальные ±. n Серотип А – разлагает казеин, Е – не разлагает, остальные ±. n Используют специальные среды, содержащие печень и фарш. n

Вопрос 9. Основной патогенетический фактор – экзотоксин (ботулотоксин – нейротоксин) n Протоксин гидролизуется эндопротеазами. n Токсин состоит из 2 -х частей: n L - легкой - Zn 2+- зависимая протеаза (50 к. Да) и n Н - тяжелой цепи (100 к. Да). n связаны S-S мостиками. n Н-цепь – якорная, прикрепляется к рецептору клетки. L-цепь – осуществляет специфическое блокирование холинэргической передачи возбуждения в синапсах. Разрушают везикулы, содержащие ацетилхолин, блокируя передачу нервного импульса.

Механизм действия ботулинического токсина (по D. Kedlaya) Слева - механизм выделения ацетилхолина из нервного окончания в синаптическую щель при помощи комплекса белков (SNAP-25, синтаксин, синаптобревин). Справа - проникновение ботулинического токсина в нервное окончание путем активного эндоцитоза с образованием токсинсодержащих везикул. В везикулах дисульфидный мостик токсина разрывается, легкая цепь выходит в цитоплазму и расщепляет транспортный белок пресинаптической мембраны SNAP-25, блокируя высвобождение ацетилхолина в синаптическую щель

Ботулотоксин действует на: n 1. двигательные нейроны спинальных моторных центров и продолговатого мозга, вызывая паралич n 2. периферические двигательные нервно- мышечные рецепторы, нарушая передачу возбудителя с нерва на мышцу

Клинические проявления ботулизма n Клинические проявления различны: n 1. диспепсия n 2. нарушение зрения n 3. нарушение дыхания n При характерных признаках ставят разные диагнозы. n Инкубационный период – 12 -24 ч – 10 сут. n Летальность 1 -60%, РФ – 9%. n Чем короче инкубационный период – тем тяжелее заболевание.

Вопрос 10. Вид Clostridium tetani n Возбудитель раневой анаэробной инфекции - столбняка. n Заболевание характеризуется острым течением, параличом ЦНС – судорогами. В ране токсин. n Столбняк – «дремлющая» инфекция – очень большой инкубационный период. n От травмы до заболевания может пройти от нескольких дней до нескольких месяцев.

Характерная поза больного столбняком

Места обитания C. tetani n в норме в испражнениях человека и животных → на предметы быта, в раны. n С испражнениями попадает в почву, где образует споры, попадая из почвы в организм, вызывает заболевания. n Характерная черта C. tetani – локализация в области поврежденной ткани (ранение, ожог, травма). n Остальные виды клостридий быстро распространяются по другим тканям.

Заболевания, вызываемые C. tetani n десен, зубов, среднего уха, возможна контаминация через иглы. n пупочная культя - n заболевание новорожденных: летальность 40% n летальность обусловлена токсинемией, болеют 2% новорожденных.

Морфология Clostridium tetani n Молодая культура состоит из длинных одиночных, подвижных Гр+ палочек, n в старой культуре Гр-. n Образуют круглые терминальные споры – барабанные палочки.

Морфология Clostridium tetani "Барабанные палочки"

Морфология Clostridium tetani

АГ структура n O- АГ и Н- АГ, n по Н-АГ выделяют 10 серотипов. Экзотоксин идентичен для всех серотипов.

Культуральные свойства n Облигатный строгий анаэроб, n опт. То 35 -37 о. С. n Среда выращивания общая для всего рода. n запах жженного рога + газ. n В ЖПС – помутнение через 48 -72 ч, n растет медленнее, чем C. perfringens. n В среде на 2 -7 день - токсин, потом он разрушается.

Рост на ППС n колонии ø 6 мм, n прозрачные серо-желтые, n через 4 -6 дней, S и R формы. n В высоких столбиках – вид чечевицы. Гемолиз на кровяном агаре, n не растут в присутствие 20% желчи и n 6, 5% Na. Cl. n Споры гибнут при 100 о. С за 1 час.

Биохимические свойства C. tetani n Ферментативные (сахаролитические) свойства – не выражены. n образуют протеазы и РНК-азы, разжижают желатин n

C. tetani выделяют экзотоксин n → в ЦНС по лимфо- и кровеносным сосудам n → приводит к гиперрефлексии и спазму скелетных мышц n → столбняк.

Токсины C. tetani n тетанолизин – разрушает эритроциты, обладает летальным действием – это кардиотоксин. n тетаноспазмин – причина спазмов. Смерть наступает при полном сознании от асфиксии и поражения жизненно важных центров. Сначала наблюдается тоническое сокращение жевательных и мимических мышц, потом затылка и спины.

Лабораторная диагностика n Материал для исследований: гной, кровь, секционный материал. n Микроскопия, но даже нахождение Гр+ палочек не дает основания для постановки диагноза, без определения токсина. n Обязательно! Определение токсина в клиническом материале и культуре. n Диагноз только после проверки сыворотки на мышах.

Профилактика и лечение n Профилактика при ранении: n вводят Ig, если не привита вакцина АКДС или вводят анатоксин n Донорский противостолбнячный Ig вводят 1 раз