Critically Appraised Topic PRV-1 gen Een nieuwe moleculaire

Critically Appraised Topic: PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera” Danielle Van der beek Assistent klinisch biologie UZ-Leuven 14 -12 -2004

Inhoud 1. Polycythemia Rubra Vera 1. 2. Symptomen Diagnose PRV-1 gen overexpressie: een nieuwe moleculaire marker voor Polycythemia Rubra Vera 1. 2. PRV-1 gen en RQ-PCR Critical Appraisel 1. 2. 3. 4. 5. 6. Analytische performantiekarakteristieken Diagnostische performantiekarakteristieken Klinische impact Organisatorische impact Kostprijs Decision making

1. Polycythemia Vera Rubra of Ziekte van Vacquez

Polycythemia Rubra Vera • Myeloproliferatieve ziekte – Verworven mutatie van een hematopoëtische pluripotente stamcel Þ Afwijkingen in de drie mergreeksen – Klassiek onderscheidt men (FAB): 1. 2. 3. 4. Polycythemia Rubra Vera Essentiële trombocytose Myelofibrose Chronische myeloïde leukemie

Symptomen • 6 e – 7 e levensdecade, Incidieus • Hyperviscositeit: hoofdpijn, duizeligheid, visusstoornissen, neusbloedingen, diffuse pijnen in de ledematen en abdomen • Tromboseneiging (perifeer + centraal) • Jeuk • Plethora • Splenomegalie • Bloedingen (GI)

Diagnose (1) Verhoogde rode bloedcel massa • Absolute of relatieve erytrocytosis? • HTC > 56% (♀) of 60% (♂): PV na uitsluiten secundaire oorzaken (PVSG) • Hb > 16, 5 g/d. L (♀) of 18, 5 g/d. L (♂): major criterium (WHO) Heike L Pahl, Diagnostic approaches to polycythemia vera in 2004, Expert Rev. Mol. Diagn. 4(4), 2004

Diagnose (2) Primaire of secundaire polycytemie? Carboxyhemoglobine gehalte? Up. To. Date Online version 12. 2 (2004)

Diagnose (3) • EPO dosage – Relatief eenvoudig - CHU Sart Tilman Luik – Laag erytropoëtine gehalte: primaire erytrocytosis – Hoog erytropoëtine gehalte: secundaire erytrocytosis • Beenmergkweek: – Autonoom in vitro laten groeien van endogene erytroïde koloniën (EEK’s) – Omslachtig, arbeidsintensief, moeilijk te standaardiseren, niet kosteneffectief • Morfologisch onderzoek van het beenmerg: – Weinig zinvol, enkel in DD. andere myeloproliferatieve ziekten – Geen criterium voor diagnosestelling van PV

Diagnose (4) • Histologisch onderzoek van beenmergbiopt: – Kan diagnose van PV bevestigen – ↑ aantal grote megakaryocyten in clusters, proliferatie van de 3 mergreeksen met vooral proliferatie van de erytropoïese hyperplasie van gedilateerde sinussen • Cytogenetische afwijkingen: – Slechts in 10 – 20% afwijkend – Bewijs klonale aandoening

Diagnose (5) Gemodifieerde PVSG-criteria volgens Berlin (2000) WHO. Tumors of the Hematopoietic and lymphoid tissues. IARC Press, Lyon, France (2001)

Diagnose – nieuwe testen (6) • Verminderde expressie van de TPO receptor (c-Mpl) in plaatjes en megakaryocyten [Moliterno et al] Þ Proliferatie van plaatjes in PV is onafhankelijk van TPO, cfr. RBC – epo • Mbv. ELISA platelet-rich plasma (PRP) serotonine levels meten in pt met myeloproferatieve aandoeningen: lagere levels in patiënten met PV, ET en myeloïde metaplasie in vergelijking met secundaire polycytemie en controle patiënten • Overexpressie van PRV-1 m. RNA

2. PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera”

2. 1. PRV-1 gen en RQ-PCR

PRV-1 gen? • PRV-1 m. RNA overexpressie in de granulocyten van perifeer bloed bij PV i. t. t. SE, CML, AML In fysiologische toestand expressie in het beenmerg perifeer bloed, geen beenmerg! • PRV-1 proteïne levels verschillen niet tussen PV en gezonde personen geen flowcytometrie, geen ELISA • PRV-1 gen – Behoort tot de u. PAR/Ly 6/CD 39 receptoren – Chromosoom 19 band region q 13. 12 -2 – Overexpressie mogelijks door aberrante transcriptie, geen structurele wijziging van het gen – Rol in de pathofysiologie van PV?

Principe real-time PCR • Oligo d. T primer bindt m. RNA • RT maakt 1 e streng c. DNA aan • RT heeft endo H aktiviteit • Dubbelstrengs c. DNA

Principe real-time PCR 1. Denaturatie = splitsen van ds c. DNA (95°) 2. Annealing = binden van de primers (60°) 3. Extension = vormen van een complementaire c. DNA-streng mbv Taqpolymerase (60°) R Q Real-time PCR: fluorofoor gelabelde probe!

R Q • Probe bestaat uit 5’ reporter label en een 3’ quencher label • Probe wordt afgebroken door de 5’ nuclease aktiviteit van het Taq- polymerase => fluorescentie ↑ • Ontstaan van 2 nieuwe identieke ds c. DNA ketens • Opnieuw denaturatie, annealing,

R R Q Q R Q • extension, denaturatie, annealing, … Þ Exponentiële vermenigvuldiging van de gewenste DNAsequentie

• Afbraak van de probe => R komt vrij => toename in fluorescentie, uitgedrukt in CT-waarde • De CT-waarde (cycle treshold) is die cyclus waarbij een bepaalde drempelwaarde voor fluorescentie overschreden wordt • Kwantitatieve bepaling: aan de hand van een IJKLIJN met standaard DNA en CT-waarden

Standaardcurve (1) • Met behulp van een plasmide: – 4018 Kbp lang – Bevat fragmenten van het PRV-1 gen en het house-keeping gen GAPDH (Dr. M. R. Veldwijk, German Cancer Research Center, Heidelberg) – Plasmide transformatie naar E. coli DH 5α, dan amplificatie – Plasmideconcentratie meten in het lysaat – Lineariseren van het plasmide – Dn concentratie geknipt plasmide meten – M. b. v. MW : aantal kopieën plasmiden berekenen • GUS (ß-glucuronidase): commerciële kit

Standaardcurve (2) • Seriële standaardreeks: – 103 kopieën/5µL – 104 kopieën/5µL – 105 kopieën/5µL • Na uitvoeren PCR: aantal kopieën t. o. v. CT-waarde Þ Standaardcurve voor GUS Þ Standaardcurve voor PRV-1 • Elk staal (in triple): – Aantal kopieën PRV-1 – Aantal kopieën GUS => Ratio kopieën PRV-1/GUS

2. 2. Appraisal

Clinical bottom line • Kwantitatieve analyse van PRV-1 m. RNA expressie met behulp van ‘real-time polymerase chain reaction’ is nuttig bij de diagnose van Polycythemia Rubra Vera of ziekte van Vacquez. • De nieuwe parameter kan gebruikt worden bij patiënten met erytrocytosis, gestegen hematocriet en/of gestegen hemoglobine voor de differentiële diagnose tussen primaire en secundaire erytrocytosis.

1. Analytische performantiekarakteristieken 1. Pre-analytische variabelen • • Perifeer bloed, EDTA-staal Flebotomie, hydroxyurea en interferon-α hebben een invloed op PRV-1 overexpressie Bij pt met erytrocytosis moet een infectieus probleem uitgesloten worden alvorens PRV-1 expressie te gebruiken bij de diagnosestelling Staalstabiliteit: RNA extractie / aanmaken van c. DNA gebeurt best binnen de 24 u

2. Analytische parameters • intra-assay variatie: – – – Elk staal wordt in triple uitgevoerd Het gemiddelde van het aantal c. DNA kopieën, corresponderend bij de respectievelijke CT waarden, wordt gebruikt voor de PRV-1/GUS ratio Gemiddelde intra-CV (%CT) (n = 23): 0, 83% • • 1, 27% voor PRV-1 0, 39% voor GUS

• inter-assay variatie: – Bij elke run wordt er een standaardcurve gemaakt m. b. v. een plasmide – Voor 5 runs: CV’s van de CT’s voor 1000, 10000 en 100000 kopieën/5µL 1000/PRV/CT 1000/GUS/CT 10000/PRV/CT 10000/GUS/CT 100000/PRV/CT 100000/GUS/CT 1 31 29, 6 28 26, 2 22, 6 2 31, 2 30, 2 27, 9 26, 9 24, 5 22, 6 3 31 29, 6 27, 7 26, 5 24, 2 23 4 30, 8 30, 1 27, 8 26, 9 24, 7 22, 9 5 31, 1 30 27, 6 26, 8 24, 7 23, 1 mean 31, 02 29, 9 27, 8 26, 66 24, 14 22, 84 SD 0, 148 0, 283 0, 158 0, 305 0, 885 0, 230 CV 0, 478 0, 946 0, 569 1, 143 3, 671 1, 008

• Accuraatheid (bias): afhankelijk van accuraatheid van de standaarden. Het opstellen, synthetiseren, zuiveren en kalibraties van DNA standaarden is van belang • Vergelijking met EPO dosage (n = 16): – Sensitiviteit PRV-1 100%, specificiteit PRV-1 100% – Groot aantal stalen met normaal EPO gehalte! – Prijs EPO: 17 € Prijs PRV-1 expressie: +/- 105 €

• Lineariteit: correlatiecoëfficiënt Binnen de range van 1 tot 1. 106: lineair verband tussen log c. DNA en de CT waarden. • Referentie range: – – • ≥ 130: PV < 130: geen PV bevestigen! (TO DO) Analytische range: Rekening gehouden met de amplificatie limiet (betrouwbaar vanaf 50 kopieën), is het analytische bereik 20 tot 40 CT’s. • Turn around time (TAT): max. 1 x/maand en min. 1 x/2 maanden

• Inschatting van het aantal te verwachten aanvragen – a. d. h. v. EPO dosage: • 51 aanvragen in 2003 • 48 aanvragen in 2004 (jan-okt) – 52 aanvragen verkregen, waarvan 9 uit de periferie (17%) • Kwaliteitscontrole: doel = de reproduceerbaarheid van de PCR bevestigen. – IQC: Het plasmide met zijn verdunningen is een controle op de verschillende stappen van de PCR Bij elke PCR moet de efficiëntie hetzelfde zijn E=10(-1/slope)-1 – EQC: (nabije? ) toekomst

2. Diagnostische performantiekarakteristieken M. Bossuyt, “Towards complete and accurate reporting of studies of diagnostic accuracy: The STARD initiative. ” Clin. Chemistry 2003; 49: 1, 1 -6 Introduction Doel: DD. PV en sec. erytrocytosis m. b. v. RQ-PCR. Methods Participants • PB van pt verdacht voor PV (symptomen) • PB van pt gekend met PV (reeds R/) • PB van 9 gezonde donoren • PB van 5 stamceldonoren onder groeifactoren retrospectieve studie! Test Methods • gouden standaard: WHO classificatie • RQ-PCR: – Isolatie WBC (Ficoll-Hypaque densiteit centrifugatie) – Lysis RBC (NH 4 CL) – RNA-extractie (Qiagen RNeasy Mini Kit) – Aanmaken van c. DNA (EAC-protocol) – Primer/probe sequenties (Julian Topaly, IG, Universiteit van Heidelberg) – PRV-1 plasmide (Dr. Veldwijk, German Cancer Reserarch Center, Heidelberg)

– PCR: • 25 µl reactie bevat 12, 5 µl Taqman Universal Master Mix 2 x (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 4, 5 µl RNAse vrij water, 300 n. M forward en reverse primers (Eurogentec, Belgium), 200 n. M Taq. Man probes (Eurogentec), en 5 µl c. DNA van het plasmide. • Elke analyse in triple op de ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems) • Negatieve controles (RNAse vrij water) • De kwaliteit van het RNA en de efficiëntie van de c. DNA synthese wordt gecontroleerd door de amplificatie van GUS • Kwantificatie PRV-1 en GUS: standaardcurven plasmiden • Uitvoering: ervaren MLT’s o. l. v. F. Houtmeyers • Stabilisatie van het RNA < 24 u => diepvries tot +/- 8 stalen verzameld • Rapportering: ratio = # kopieën PRV-1/ # kopieën GUS Aanvankelijke cut-off: 100 Results Participants • van ‘ 03 tot eind ‘ 04 / Gem. lft studiepopulatie 61 jaar (34 ♂, 17 ♀) • Twee groepen: – groep pt die nog geen behandeling had gekregen (n = 42) – groep PV pt die reeds therapie gekregen hadden (n = 9) • UZ Leuven (n = 42), Aalst (n = 7), Dendermonde (n = 2)

Test results • gezonde donoren: range 2, 64 - 39, 4; mean 8, 9 • Stamceldonoren onder GF: range 77, 6 – 230, 4; mean 139, 5 • PV, reeds R/: range 6, 2 – 1147; mean 271 • PV, niet R/: range 140, 1 – 1372; mean 681, 8 • Sec. erytrocytosis: range 0, 4 – 129, 2; mean 34, 8 Invloed van therapie! Bij exclusie groep reeds R/: cut-off 130 Estimates • Sensitiviteit: 100% Specificiteit: 100% • LR+ve= oneindig LR-ve = 0 • NND = 1 • Reproduceerbaarheid: intra-assay 0, 83% inter-assay 1, 3% Discussion 1. 2. Hoewel kleine studiepopulatie: kwantitatieve analyse van PRV-1 m. RNA heeft een waarde bij de diagnosestelling van pt met erytrocytosis. Cut-off 130 bevestigen (TO DO)

disease no disease 1 0, 4 2 2 3 5, 95 4 7, 4 5 7, 5 6 7, 8 7 7, 9 8 10 9 11 10 11 11 18, 06 12 18, 7 13 19, 3 34 140, 1 14 20 35 153, 9 15 21, 6 36 163 16 21, 66 17 21, 66 37 279 18 29 38 321, 9 19 29 39 324 20 29, 5 40 1029, 9 21 31, 05 41 1372 22 41, 5 42 2352 23 43, 77 24 46 25 49 26 51, 2 27 52 28 71 31 Niet-PV 64, 7 30 PV 56 29 88 32 127 33 129, 2 no disease

3. Klinische impact • Diagnostisch aspect: • nut bij diagnose PV (DD. prim/sec erytrocytosis) • Evt. EPO dosage en/of EEK’s vervangen • Cytologie levert geen meerwaarde op in de diagnostiek van PV (tenzij DD. myeloproliferatieve ziekte) • Botboorbiopsies: richtinggevend • cytogenetica: minderheid + • Behandeling: interferon: down-regulatie van PRV-1 expressie: merker voor klinische respons? • Health outcome: juiste diagnosestelling! In de literatuur (nog) geen evidentie dat PRV-1 gen bepaling de outcome verbetert • Prognose en follow-up: /

4. Organisatorische impact • Impact in het ziekenhuis: – Beenmergcytologie is geen criterium. Morfologisch onderzoek vergt +/ - 1 uur werk voor MLT/GSO-ASO/supervisor – Beenmergkweek is tijdrovend en kostelijk. Momenteel wordt het enkel uitgevoerd bij twijfel over de diagnose (http: //intranet/patientenzorg/procedures. protocols. html) – Er is geen verkorting hospitalisatieduur (meestal ambulante setting) • Is PRV-1 geïncorporeerd in klinische richtlijnen of guidelines? H. L. Pahl “Diagnostic approaches to polycythemia vera in 2004” Expert Rev. Mol. Diagn. , 2004; 4(4) – ‘European Leukemia Network’ zal binnen enkele maanden guidelines publiceren voor de standaardisatie van het RQ-PCR assay – Voorstel PVSG criteria verder aan te passen

Diagnose PV: A 1 + A 2 + A 3 of A 4 A 1 + A 2 + twee B’s H. L. Pahl “Diagnostic approaches to polycythemia vera in 2004” Expert Rev. Mol. Diagn. , 2004; 4(4)

5. Kostprijs: binnen en buiten het labo • Actuale kost Rekening houdend met de reagenskost, distributiekosten, primaire en secundaire activiteiten: 105 € per patiëntenstaal in batch van 10 stalen • Terugbetaling CMD’s ontvangen een ‘enveloppe’, geen RIZIV tussenkomst • Voordeel elders in het ziekenhuis 1. PRV-1 kan EPO dosage vervangen 2. PRV-1 expressie + EPO dosage kan beenmergkweek vervangen (moeilijke standaardisatie, arbeidsintensief, niet kosten-effectief) 3. RBC-massa bepaling is niet steeds nodig (volgens clinici routinematig aangevraagd) – HTC > 56% (♀), HTC > 60% (♂) => PV (PVSG) – Hb > 16, 5 g/d. L (♀), Hb > 18, 5 g/d. L (♂) : major criteria volgens WHO

6. Decision making • Impact van PRV-1 op het klinisch beslissing proces – VOORSTEL DIAGNOSEREGEL: • Klinische vermoeden van PV Uitsluiten ET ! • HTC > 52 % (♂), HTC > 48 % (♀) (uptodate) • HTC > 50% (♂), HTC > 48% (♀) (http: //intranet/patientenzorg/procedures. protocols. html) – Beenmergmorfologie is een overbodig onderzoek – RBC massa bepaling is niet steeds nodig • Past de test binnen het eigen labo profiel? – De test staat volledig op punt. De PCR is gelijkaardig aan andere realtime PCR’s: minimum aan opleiding MLT – Lage frequentie test: uitvoeren indien er tijd is – Stalen opsturen naar ander labo: verlies kwaliteit (cfr. Stabiliteit!) • Besluit: flowchart

Vermoeden PV WHO STAP 1 STAP 2 Trombocytosis (> 400 x 109/l) WBC (> 12 x 109/l) Splenomegalie (klinisch/echo) DD Absolute of relatieve erytrocytose? PVSG HTC > 56% vrouw HTC > 60% man Ja: stap 3 STAP 3 Gestegen hematocriet / hemoglobine WHO * Hb > 16, 5 g/dl vrouw Hb > 18, 5 g/dl man Neen: RBC-massa bepalen Relatieve erytrocytose: diurectica, dehydratatie, vochtsequestratie Absolute erytrocytose: secundaire of primaire erytrocytose? • zuurstofsaturatie: gedaald • carboxyhemoglobinegehalte verhoogd: rookstop 3 -4 m • PRV-1 expressie • botbiopsie • cytogenetica • (EPO) • (beenmergkweek) *Dit criterium is minder streng aangezien 18, 5 g/dl en 16, 5 g/dl ongeveer overeenkomt met een hematocriet van 54 en 48

TO DO / ACTIONS • Reëvalutie cut-off • Opstellen van een werkvoorschrift indien de test in de routine komt • Aanvragers uit periferie verwittigen voor staalstabiliteit

Dank u voor uw aandacht! Speciale dank aan: Dr. N. Boeckx Dr. J. Frans Houtmeyers Prof. F. Van Stapel