COURS CELULES SOUCHES (D. Aberdam) 2010 Ma 2/3: cours 1: Définitions et généralités sur les CS Ve 5/3: cours 2: CS somatiques et plasticité Ma 8/3: cours 3: CS hématopoëtiques (Dr. Rouleau) Ve 12/3: cours 4: CS embryonnaires Ma 16/3: Partiel 1 Ve 19/3: cours 5: CS adultes et physiopathologie Ma 23/3: cours 6: CS reprogrammées (i. PS) + labo Ve 26/3: Cours 7: CS tumorales Partiel 2 Ma 30/3: Partiel 2 Examen: 28 mai
kératinocyte Cytokératines BP 280 Plectine Collagène VII
kératinocyte Hémidesmosomes Cytokératines BP 280 Plectine Collagène VII
EPIDERMOLYSIS BULLOSA Epidermolyse Bulleuse Simplex (EB) Epidermolyse Bulleuse Jonctionnelle Epidermolyse Bulleuse Dystrophique Cytokeratines 5/14 BP 280 Plectine EBS (R) Peau EB Epiderme EBJ (R) EBD (D et R) Collagène VII Derme
Anticorps monoclonal GB 3 Immunisation de souris par des antigènes Collecte du sérum (lymphocytes B) Fusion des lymphocytes B avec une lignée lymphoma: hybridome Sélection clonale d’un hybridome
Anticorps monoclonal GB 3
Anticorps monoclonal GB 3 Cytokeratines K 5/K 14 BP 280 Plectine EBS Intégrine 6 4 EBJ EBD Collagène VII
• Epidermolyse bulleuse jonctionnelle(EBJ) * contrôle * EBJ *
Cellules du patient ADN génomique ARNm Protéines Southern blot Northern blot Western blot PCR RT-PCR IP Banque génomique Banque d’ADNc Anticorps Ch. IP Banque d’expression
Molécule trimérique, sécrétée dans la MEC Protéine sécrétée IF IP
Colonne d’affinité GB 3 Criblage de banque d’expression Anticorps polyclonaux Clonage et séquençage RT-PCR et clonage Sequençage de peptides Oligonucléotides dégénérés
kératinocyte 1 q 25 -q 31 18 p 11. 3 1 q 32 Cytokératines BP 280 Plectine NH 2 Intégrine 6 4 Laminine-5 - 2 Collagène XVII (BP 180) Collagène VII Laminine-5
Immunofluorescence sur biopsies cutanées 3 Contrôle Patient 3 2
Liaison génétique entre le gène LAMC 2 et l’EBJ-H Difficultés: trois gènes. caractère récessif et léthal 3 familles consanguines Recherche de microsatellites CA/GT proches (ou dans le locus LAMC 2) 3 marqueurs AFM + un microsatellite lié à LAMC 2 (variabilité de 13 allèles # dans la population caucasienne) CACA…. CACA
gène ADNc C 5’ P 3’ C Hétéroduplex Homoduplex P
Famille consanguine. Patient homozygote contrôle T C G A Mutant T C G A 3 ’ A Arg G C 5 ’ Stop A G T 3 3 2 N M N M Exon 3 Northern blot
Allele-Specific Oligonucleotide (ASO) Example d’une famille non consanguine Mutation portée par la mère Mutation portée par le père
Formes non léthales d’EBJ • Expression réduite de laminine-5 mutée • Etat traumatique, sans soins efficaces
THERAPIE GENIQUE CUTANEE Ex vivo Diagnostic génotypage biopsie cutanée culture in vitro de kératinocytes transduction rétrovirale greffe feuillets épithéliaux
Thérapie génique des EB Phénotype/génotype: - diagnostic (immunohistologie, moléculaire) - recherche de mutation Transfert de gène: - primo culture - choix du vecteur (lentivirus, intégrases, …) - réversion phénotypique Transplantation: - modèles animaux - prise de greffe - évaluation de la réponse immunitaire - expression du transgène in vivo sur du long terme - évaluation des risques de mutation insertionnelle du transgène
PRODUCTION D ’UN VIRUS « CURATIF » Laminine 5 Vecteur viral Production de particules virales Culture in vitro de kératinocytes EB
Réversion phénotypique de kératinocytes EBJ Chaîne ß 3 - mutations R 42 X / E 210 K EBJ-R WT EBJ-R
80 reverted EBJ DC 100 80 60 60 40 40 20 reverted 20 0 10 20 30 0 min EBJ 10 20 30 min Vinculine 100 detached cells (%) 100 detached cells EBJ MC 80 60 wt 40 EBJ-R reverté K EBJ 20 0 5 minutes 10 15
Applications potentielles de la thérapie génique cutanée correction de défauts géniques catabolisme de toxines circulantes sécretion de médicaments diffusibles
Correction du phénotype d’obésité par transplantation d’une peau transgénique Larcher et al. (2001). FASEB J 15: 1529 -38 Promoteur K 5 -leptin-Lac. Z Day 9 1 Day 32 Souris ob/ob Greffe d’épiderme human exprimant la leptine serum leptin (ng/ml) 2 2, 5 2 1, 5 1 0, 5 0 Leptin HK control 0 5 10 days 15
Retinite pigmentaire (cécité chez l’enfant). Touche les photorécepteurs (RPE) et l’enzyme RPE 65 Permet la conversion du signal lumineux en signal électrique. rescue (15 min) rescue (2 months) rescue (8 months) normal eye
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