Часть 6 Апоптоз Во время жизни животных

Часть 6 Апоптоз

Во время жизни животных и человека наблюдается 2 типа ЗПКГ: апоптоз и аутофагия (m. TOR). Термин ввели Kerr с соавт. в 1971 г. Через 20 лет открыто новое семейство протеаз – каспазы.

Механизмы апоптоза

Изменение ультраструктуры клеток при некрозе и апоптозе

Последовательность событий при апоптозе (справа) и некрозе (слева)

Функции апоптоза

Стадии апоптоза • 1. Индукция. Изменения в клеточном окружении, приводящие к активации апоптоза через R и СТ • 2. Исполнение. Клетка решает войти в апоптоз. • 3. Дегенерация. События, связанные с конечным развертыванием клеточных процессов, позволяющих подойти клетке к точке, откуда нет возврата.

Индукторы и супрессоры апоптоза • Индукторы: дефицит ФР, глюкозы, УФ и гаммаизлучение, перекись, ПОЛ, ГК гормоны, ТХДД, ФНО, экспрессия проапоптотических генов сем. Bcl-2 цитолитические Т-лимфоциты, вирусы, химиотерапевтические лекарства и др. • Супрессоры: экспрессия антиапоптотических генов сем. Bcl-2, MDR, теломеразы, ингибиторы синтеза РНК и белков, мут. р53 и др.

Сигналы к апоптозу

Сборка каспаз Общая структура прокаспаз и протеолитическое созревание расщеплением после остатков аспарагина. В результате генерируется большая с (р20) и малая (р10) субъединицы, в каждой из которых формируется активный центр (кружок). Два гетеродимера складываются в тетрамер.

Функциональные взаимодействия между каспазами

Структурная организация каспаз Structure and domain organization of mammalian caspases. (a) Domain organization of caspases and the location of catalytic center loops (L 1–L 4). Initiator caspases have long prodomains, CARD or DED, whereas executioner caspases have short prodomains. Loops are shown in gray. The active site Cys is shown by a red line. Processing that separates p 20 and p 10 subunits occurs in L 2. The resulting larg e subunit potion of the L 2 loop of one monomer and small subunit portion of the L 2 loop of the neighboring monomer (L 20) are involved in loop bundle formation (b and c). (b) Ribbon representation of the active caspase-3 structure showing the positions of the active center loops (L 1 -L 4, L 20) based on the crystal structure of the complex of caspase-3 with peptide inhibitor (in pink). Reproduced with permission from Shi (2002). (c) The active site conformations of the caspases with known structures. Loops L 1 and L 3 are highly conserved, whereas L 2 and L 4 are responsible for the differences in substrate binding specificity. Reproduced with permission from Shi (2002). CARD, caspase recruitment domain; DED, death effector domain

Лиганды и рецепторы • Лиганды: сем. гомотримерных лигандов TNF - Fas. L, TRAIL (Apo 2 L), TNF α и β, CD 40 L, CD 27 L, OX 40 L. • Рецепторы: FAS и др. рецепторы семейства TNF

Взаимодействие лиганда смерти TRAIL с рецептором

Зависимый от Fas-рецептора апоптоз при действии цитотоксического Т-лимфоцита

два варианта рецептор-опосредованного апоптоза

Передача КС при апоптозе

Fas/FADD/pro-caspase комплекс образует Fas deathinducing signaling complex (DISC)

TNF-R 1 инициирует образование 2 -х комплексов Комплекс I (голубой) содержит TNF-R 1, адаптор TRADD, receptor interacting kinase (RIP), и TNF-receptor ssociated factor 2 (TRAF 2). TNF-α активирует NF-k. B путь, который индуцирует гены выживания c-FLIP. Позже из комплекса I диссоциируется и интернализируется TNF-R 1.

Потеря экспрессии FADD дает раковой клетке преимущество выживание/рост

Ключевая роль NF-k. B

Митохондриальный апоптоз

2 пути мтх. апоптоза

Множество белков IMS (intermembrane space) высвобождается, когда активируются внутриклеточные сигналы индукции апоптоза Целостность митохондриального матрикса контролируется Bcl-2 сем. BH-3 -белки активируются при стрессе. Bid, например, расщепляется многими протеазами (caspase-8, granzyme B и cathepsin B) в t. Bid, который взаимодействует с антиап. Bcl-2 белками и может напрямую активировать Bax. Другие BH-3 -белки ненапрямую активируют Bax, блокируя антиап. Bcl-2. Цитозольный cyt c запускает образование апоптосомы через каскад каспаз. Для них много субстратов: ICAD, в результате активируется CAD, к. транслоцируется в ядро и начинает олигонуклеосомальную фрагментацию ДНК. IAPs предотвращает димеризацию caspase-9 и блокирует активные caspase-3 и -7. Smac/DIABLO (Smac) и Htr. A 2/OMI (Omi) нейтрализуют Ингибирующий эффект IAP связыванием с BIR 2 и BIR 3 доменами. Димерный Smac/DIABLO связывает BIR 1 и BIR 2, а Htr. A 2/ OMI преимущественно связывает BIR 2 белка XIAP. Кроме того, Omi может расщеплять IAPs благодаря серин-протеазной активности. Smac – субстрат для деградации УБ-протеосомами, находясь в C-terminal RING домене белка XIAP и c. IAP 1 и c. IAP 2. AIF и endonuclease G (endo G) переходят из мтх. В ядро, где расщепляют ДНК (независимо от каспаз).

Механизмы MOMP

Модель образования протеосомы

Активация каспаз

CK-2 киназы – субстраты для каспаз

CK-2 киназы в митозе Схематическое изображение CK 2 a и CK 2 b с сайтами ф-я (треонины 344 и 360, серины 362 и 370 в CK 2 a, серин 209 в CK 2 b) черным. (B) Модель временной регуляции ф-я CK 2 a (C) Модель ф-ия CK 2 в митозе. После ф-ия CK 2 киназой Cdk 1, CK 2 a C-terminal ф. сайты могут связываться с пролил изомеразой Pin 1. Образование комплекса Pin 1, Topoisomerase II, и ф-ый CK 2 a вызывает снижение фия Topoisomerase II киназой CK 2. Митотическая киназа Plk 1 может также связаться с C-terminal CK 2 a по ф. сайту. Но функция этого взаимодействия неизвестна.

Роль CK-2 в клеточных процессах

Состав семейства Bcl-2 генов

Способы взаимодействия между белками Bcl-2

Meeting points Bcl-2

Регуляция мтх. апоптоза (1)

Регуляция мтх. апоптоза (2) (a) Модель реостата. Обычно в клетке равновесие. Дисбаланс белков bcl-2 семейства, например, повреждение ДНК, ведет к синтезу проапоптотических молекул и активации МОМР. Добавление GF может, напротив, увеличить синтез антиапоптотических белков. (b) Модель нейтрализации антиапоптотических белков. BH 3 only белки BID, BIM и PUMA вызывают mitochondrial outer membrane permeabilization, нейтрализуя анти-апоптотические белки.

Механизмы активации про-апоптотических белков (1) Модель прямой активации. (a) MOMP активируется через олигомеризацию BAX или BAK. Эти белки, один раз активируется BH 3 -only белком, образуют протеолипидные поры. (b) Прямой активатор BH 3 -only белков (e. g. BIM and BID) индуцирует олигомеризацию BAX или BAK при отсутствии других белков

Механизмы активации про-апоптотических белков (2) (c) A subset of BH 3 -only proteins, the derepressors/sensitizers, cannot induce the activation of BAX or BAK alone. In this scenario, a direct activator BH 3 -only protein is sequestered by an anti-apoptotic BCL 2 protein. Following stress, a de-repressor/sensitizer BH 3 only protein is induced, either by transcriptional up-regulation or by post-translational modification, and this protein then binds to an anti-apoptotic BCL-2 protein, promoting the release of a sequestered, direct activator BH 3 only protein. In this example, BIM is tonically sequestered by MCL-1, and the induction of Noxa enables the release of BIM to engage MOMP. If cells constitutively harbor a sequestered direct activator protein, they are referred to as being ‘primed for death’ or ‘BCL-2 addicted’. Not shown in this figure is the potential influence of Noxainduced MCL-1 degradation after binding, which might have important implications in maintaining anti-apoptotic levels to preserve outer mitochondrial membrane integrity [53]. (d) Cells are sensitized to undergo MOMP when de-repressor/sensitizer BH 3 -only proteins are constitutively inhibiting anti-apoptotic BCL-2 proteins, and any future induction of BID or BIM cannot be tolerated. This scenario is referred to as ‘sensitized for death’. In this example, BCL-x. L is inhibited by BAD, and the induction of BIM engages MOMP; in the absence of BAD expression, the MOMP signal would have been inhibited by BCL-x. L.

Основные пути апоптоза (1)

Основные пути апоптоза (2)

Интегральная схема регуляции

Регуляция апоптоза ингибиторными белками

Различная организация BIR

Взаимодействие с каспазой 3 (а) и IPVA (b)

Взаимодействие с каспазой 9 (а) и Smac/DIABLO (b)

Селективное связывание IAP белков

Баланс между убиквитиляцией и автоубиквитиляцией c. IAP 1 and c. IAP 2

Протеолиз и апоптоз Conjugation of Ub to target proteins is mediated by E 1, E 2 and E 3 enzymes. The Ub-activating enzyme E 1 (ubiquitin-like modifier activating enzyme 1 [Uba-1] in mammals) activates Ub through ATP-dependent thiolester formation. The Ub-conjugating enzyme (E 2) receives Ub from the E 1 and interacts with the E 3 to transfer Ub to the target molecule. The E 2 usually determines the type of Ub chain linkage, whereas E 3 ligases provide substrate recognition. Ub chains are synthesized by multiple rounds of Ub attachments, using internal lysine residues of Ub (shown here: K 48 and K 63) as conjugation sites. The different types of chains adopt different topologies with K 48 being kinked, whereas K 63 -linked chains are linear. Depending on the type of modification, protein ubiquitylation has distinct cellular outcomes. Ub E 3 ligases can also be subject to auto-modification to regulate their levels.

IAPs функция как E 3 лигаз и Ub рецепторы в TNF-signalling Domain structures of c. IAPs. BIR domains provide substrate interaction, whereas the Ubbinding UBA domain binds poly. Ub. The caspase recruitment domain (CARD) is a protein–protein interaction domain, but is not involved in caspase binding here. The Cterminal RING domain is required for E 3 ligase activity, dimerization interface and docking site for the E 2. A predicted structure of the three conserved a-helices of the UBA domain (green) of c. IAP 2 and the residues forming the hydrophobic interaction surface for Ub (consisting of Met-Gly-Phe [MGF] and Leu-Leu [LL]) is shown [66]. The structure of a c. IAP 2–RING dimer is shown on the right (grey and green depict two respective c. IAP 2 molecules)

Suggested functions for c. IAPs in TNF-R signalling. Stimulation with TNFa triggers the formation of ‘complex-I’ at the TNF-R, in which c. IAP has been suggested to K 63 -ubiquitylate RIP 1. These linear Ub chains serve as docking and activation platforms for the IKK complex, which leads to activation of the transcription factor NF-k. B (p 65/p 50). c. IAPs also seem to suppress the death-inducing ‘complex-II’, which is the activation platform for caspase-8 that induces death by the extrinsic pathway.

Методы определения фрагментации ДНК

Детекция апоптоза

Электрофореграмма ДНК при апоптозе

Олигонуклеосомная фрагментация ДНК при апоптозе

Типичная картина апоптоза

Молекулярный имидж клеточной гибели (2009)

Гистологическое окрашивание срезов печени мыши (контрольных и обработанных anti-Fas) H&E staining of normal (A) and anti -Fas treated livers (B). TUNEL of normal (C) and anti-Fas treated livers (D) with clearly more positively stained cells. Caspase-3 shows a clear increase of positively stained cells in an anti-Fas treated liver (F) compared to a normal liver (E). Autoradiography images are shown for liver slices of mice injected with 99 m. Tc-HYNIC-cysanx. V before (G) and after treatment of the animals with anti-Fas (H).

In vivo planar image of a control rat and a rat with reperfused hepatic infarction at 7 h post injection of 99 m. Tc(CO)3 -bis-DTPA pamoate (A). Autoradiographs of 30 -μm liver slices of the necrotic liver (B, top row) and viable liver (B, bottom row) and scanned photographs of the same slices after H&E staining (C) staining show good correlation with the in vivo planar image.

Апоптоз в опухоли после химиотерапии (А, В – не леченные, H&E и TUNEL окрашивание)

Определение активности каспаз

Определение каспаз

Проточная цитометрия в определении апоптоза

Определение мит. апоптоза

Апоптоз в нейронах

Апоптоз в нейронах

Макрофаги в определении апоптоза

Взаимодействие макрофагов с апоптотическими клетками

Терапевтические мишени для ингибирования апоптоза (доклиническая стадия)

ЗПКГ выполняет критическую роль в развитии нервной системы у позвоночных. Около 50% всех нейронов гибнет через апоптоз