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Chapter 2 Properties of Nucleic Acids Chapter 2 Properties of Nucleic Acids

2. 1 Nucleic Acid Structure (DNA & RNA): bases nucleosides nucleotide phosphodiester bonds primary 2. 1 Nucleic Acid Structure (DNA & RNA): bases nucleosides nucleotide phosphodiester bonds primary sequence structure, modified nucleic acids 2. 2 Chemical and Physical Properties of Nucleic Acids (DNA & RNA): stability (force), chemical properties (acid, alkali, chemical denaturation), physical properties (viscosity, buoyant density) 2. 3 Spectroscopic and Thermal Properties of Nucleic Acids (DNA & RNA): UV absorption, hyperchromocity, quantitation and purity 2. 4 DNA Supercoiling (DNA): closed circular molecule, supercoiling & energy, topoisomer & topoisomerase

2. 1 Nucleic Acid Structure (DNA & RNA): Bases Bicyclic Purines: Monocyclic pyrimidine: Thymine 2. 1 Nucleic Acid Structure (DNA & RNA): Bases Bicyclic Purines: Monocyclic pyrimidine: Thymine (T) is a 5 -methyluracil (U)

2. 1 Nucleic Acid Structure (DNA & RNA): Nucleosides The bases are covalently attached 2. 1 Nucleic Acid Structure (DNA & RNA): Nucleosides The bases are covalently attached to the 1’ position of a pentose sugar ring, to form a nucleoside Glycosidic (glycoside, glycosylic) bond (糖苷键) R Ribose or 2’-deoxyribose Adenosine, guanosine, cytidine, thymidine, uridine

2. 1 Nucleic Acid Structure (DNA & RNA): Nucleotides A nucleotide is a nucleoside 2. 1 Nucleic Acid Structure (DNA & RNA): Nucleotides A nucleotide is a nucleoside with one or more phosphate groups bound covalently to the 3’-, 5’, or ( in ribonucleotides only) the 2’-position. In the case of 5’-position, up to three phosphates may be attached. Phosphate ester bonds Deoxynucleotides (containing deoxyribose) Ribonucleotides (containing ribose)

BASES Adenine (A) NUCLEOSIDES NUCLEOTIDES Adenosine 5’-triphosphate (ATP) Deoxyadenosine 5’-triphosphate (d. ATP) Guanine (G) BASES Adenine (A) NUCLEOSIDES NUCLEOTIDES Adenosine 5’-triphosphate (ATP) Deoxyadenosine 5’-triphosphate (d. ATP) Guanine (G) Guanosine Deoxyguanosine Cytosine (C) Cytidine Deoxycytidine Uracil (U) Thymine (T) Thymidine/ Deoxythymidie Guanosine 5’-triphosphate (GTP) Deoxy-guanosine 5’-triphosphate (d. GTP) Cytidine 5’-triphosphate (CTP) Deoxy-cytidine 5’-triphosphate (d. CTP) Uridine 5’-triphosphate (UTP) Thymidine/deoxythymidie 5’-triphosphate (d. TTP)

2. 1 Nucleic Acid Structure (DNA & RNA): Phosphodiester bonds & primary sequence Primary 2. 1 Nucleic Acid Structure (DNA & RNA): Phosphodiester bonds & primary sequence Primary sequence: 5’end: not always has attached phosphate groups 3’ end: free hydroxyl (-OH) group Phosphodiester bond

2. 1 Nucleic Acid Structure : DNA double helix • Watson and Crick , 2. 1 Nucleic Acid Structure : DNA double helix • Watson and Crick , 1953 • The genetic material of all organisms except for some viruses • The foundation of the molecular biology

 • Two separate strands Antiparellel (5’ 3’ direction) Complementary (sequence) Base pairing: hydrogen • Two separate strands Antiparellel (5’ 3’ direction) Complementary (sequence) Base pairing: hydrogen bonding that holds two strands together Essential for replicating DNA and transcribing RNA • Sugar-phosphate backbones (negatively charged): outside • Planner bases (stack one above the other): inside 3’ 5’

7 561 8 9 4 3 2 4 32 1 G: C A: T 7 561 8 9 4 3 2 4 32 1 G: C A: T Base pairing

 • Helical turn: 10 base pairs/turn 34 Ao/turn • Helical turn: 10 base pairs/turn 34 Ao/turn

Several forms of DNA… • Two types of DNA right-handed helix(右手螺旋) :A-DNA and B-DNA Several forms of DNA… • Two types of DNA right-handed helix(右手螺旋) :A-DNA and B-DNA left-handed helix (左手螺旋) :Z-DNA • DNA的水溶液通常为B-DNA,另外 A-T丰富的DNA 片段常呈现B-DNA; • DNA的双链中一条被相应RNA链所替换,就会形成ADNA。如,在杂交分子或DNA处于转录状态时; • B型 DNA中的多聚G-C区易形成左手螺旋DNA, 即Z型 DNA

双螺旋 碱基倾角 碱基距离 螺旋直径 每轮碱基数 螺旋方向 B-DNA 1 0. 34 2. 37 10. 4 双螺旋 碱基倾角 碱基距离 螺旋直径 每轮碱基数 螺旋方向 B-DNA 1 0. 34 2. 37 10. 4 右手 A-DNA 19 0. 23 2. 55 11 右手 Z-DNA 9 0. 38 1. 84 12 3 -14 左手

DNA 结构的动态性与精细结构 1 在正常细胞的水环境中DNA以B-DNA为基本构象,脱水 或盐浓度升高时,转变为A-DNA。 2 细胞内阳离子较多时交替的GC区段一般处于B-DNA, 在嘧啶被甲基化后,转向Z-DNA,转录活性降低。 3 某些Z-DNA结合蛋白能作为一种特异识别信号,使BDNA转变为Z-DNA。 4 在转录区域B-DNA与RNA形成A型结构。 总之, DNA的结构是处在动态的变化中的,与其功能相 DNA 结构的动态性与精细结构 1 在正常细胞的水环境中DNA以B-DNA为基本构象,脱水 或盐浓度升高时,转变为A-DNA。 2 细胞内阳离子较多时交替的GC区段一般处于B-DNA, 在嘧啶被甲基化后,转向Z-DNA,转录活性降低。 3 某些Z-DNA结合蛋白能作为一种特异识别信号,使BDNA转变为Z-DNA。 4 在转录区域B-DNA与RNA形成A型结构。 总之, DNA的结构是处在动态的变化中的,与其功能相 适应。

三股螺旋DNA (Trpile Helix DNA, T. S DNA) (1) T. S DNA 的发现与证实 l 1953 三股螺旋DNA (Trpile Helix DNA, T. S DNA) (1) T. S DNA 的发现与证实 l 1953 年以前Pauling (Chemist) 提出 T. S DNA 存在的可能性 l 1953 年 Watson & Crick 提出D. S DNA model 证明沿大沟存在多余的氢键给体与受体 潜在的专一与DNA (蛋白质) 结合的能力 形成T. S DNA 可能性 3 -16

l 1957年Davis , Felsenfeld , Rich 发现 poly(U) + poly(A) T. S RNA T. l 1957年Davis , Felsenfeld , Rich 发现 poly(U) + poly(A) T. S RNA T. S DNA的概念 但由于D. S DNA的提出 而被忽视 l 1963年Hoogsteen 提出了DNA三螺旋结构理论 l 1966年Miller & Sobell 实现 RNA + D. S DNA Triple poly Nt as Repressor 关闭基因 但因证明 Lac. I 产物为 Repressor 而被 忽视 3 -17

l 1987 年 Mirkin. S. M Nature 330 (495) 证明plasmid DNA 在 p. H= l 1987 年 Mirkin. S. M Nature 330 (495) 证明plasmid DNA 在 p. H= 4. 3的溶液中, 有T. S DNA的存在 ● 1987年 Dervan. Moser Science 238 (645) 合成S. S DNA + D. S DNA → T. S DNA • 实现DNA的定点切割 • 研究X-ray photograph • 核磁共振 → 结构功能 3 -18

(2) T. S. DNA的类型(分子内的DNA三螺旋结构) 1) D. S. DNA + S. S. DNA T. S. (2) T. S. DNA的类型(分子内的DNA三螺旋结构) 1) D. S. DNA + S. S. DNA T. S. DNA ☆ PU + PU/PY (偏碱性介质 中稳 定) ☆ PY + PU/PY (偏酸性介质 中稳 定) 常见类 型 l第三条链位于B-DNA的 Major groove中 l与D. S. DNA一起旋转 3 -19

2) D. S. DNA + D. S. DNA T. S. DNA + S. S. 2) D. S. DNA + D. S. DNA T. S. DNA + S. S. DNA Poly. T/A TTTTTTTTTTT AAAAAAAAAA 3 -20

a)分子内同源回文(Homologous palindromic sequence) in a D. S. DNA (mirror image structure) Mirkin (1987) p. a)分子内同源回文(Homologous palindromic sequence) in a D. S. DNA (mirror image structure) Mirkin (1987) p. GG 332 plasmid DNA -------TTCCCTCTTTCCC------CCCTTTCTCCCTT-----AAGGGAGAAAGGG-----GGGAAAGAGGGAA---- ----TTCCCTCTTTCCC-------AAGGGAGAAAGGG------- Nodule DNA Hinged DNA -------TTCCCTCTTTCCC----- ----AAGGGAGAAAGGG---- free DNA 3 -21

b) 分子间 D. S. DNA + S. S. DNA T. S. DNA 形成结 DNA(Nodule b) 分子间 D. S. DNA + S. S. DNA T. S. DNA 形成结 DNA(Nodule DNA)or 铰链 DNA(Hinged DNA) 三链螺旋 Hinged DNA a 双链螺旋 b 3 -22

3) D. S. DNA + S. S. DNA T. S. DNA 平行的DNA三螺旋结 构 l第三条链位于B-DNA的 3) D. S. DNA + S. S. DNA T. S. DNA 平行的DNA三螺旋结 构 l第三条链位于B-DNA的 Major groove中 l与D. S. DNA一起旋转 3 -23

4)T. S. DNA 的连接键 a. Watson bonding A = T G ≡ C (D. 4)T. S. DNA 的连接键 a. Watson bonding A = T G ≡ C (D. S. DNA) b. Hoogsteen bonding G = C+ (p. H 小于7) H+ c. 第三链 质子化 第二链的 purine 6‘, 7’与第三 链的碱基形成 H 键。 G = C+ A = A (同向平行,反向平行) T = A G = G ( 同向平行,反向平行) 3 -24

Py Pu * Py+ Py Pu * Pu 3 -25 Py Pu * Py+ Py Pu * Pu 3 -25

(4) 三股螺旋DNA形成的条件及结构特点 第三条单链DNA分子 • 位于B-DNA大沟内 • 与B-DNA以 Hoogsteen 键连接 Major groove • 在 Py (4) 三股螺旋DNA形成的条件及结构特点 第三条单链DNA分子 • 位于B-DNA大沟内 • 与B-DNA以 Hoogsteen 键连接 Major groove • 在 Py / Pu * Py 结构中 A T , G C两氢键配对 C质子化 镜相结构 必需条件 • 在 Py / Pu * Pu结构中 Triple helix Py : Pu : Py 3 ed 有多种配对方式,不一 定需要序列的镜向结构 3 -26

l无论何种形式的三螺旋 DNA, 第二股中间 链必须是 Purine 链 l 第三股链至少长于8 d. Nt l 真核生物基因组 内, 约 l无论何种形式的三螺旋 DNA, 第二股中间 链必须是 Purine 链 l 第三股链至少长于8 d. Nt l 真核生物基因组 内, 约 1%左右的序列为 大于100 bp 的homologous cluster (重复序 列与调 控序列),T. S. DNA多存在于其中。 3 -27

(5) T. S. DNA可能的功能 a) T. S. DNA可阻止调节蛋白与 DNA结合, 关闭基因 转录过程。 b) T. S. (5) T. S. DNA可能的功能 a) T. S. DNA可阻止调节蛋白与 DNA结合, 关闭基因 转录过程。 b) T. S. DNA 与基因重组交换有关。 c) 加入第三条S. S. DNA 作为分子剪刀(molecular scissors), 定点切割DNA分子。 d) 加入反义的第三条链(anti-sence polyd. Nt) 终止 基因的表达。

3. 4. 4 四股螺旋DNA ( tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA ) 发现 1958. Poly( 3. 4. 4 四股螺旋DNA ( tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA ) 发现 1958. Poly( I ) X-ray photograph 碱基形成环状氢键连接结构 Tetrable Helix DNA • Poly (G), 4 (d. G) • 染色体端粒高度重复的 DNA序列 5’---TTAGGGTTAGGG-3’ 均有形成 四股螺旋DNA 3’---AATCCC-5’ 的可能 • 着丝点附近的高度重复序列 3 -29

Linked by Hoogsteen Bonding 结构特点 7 G 6 7 7 G 6 6 G Linked by Hoogsteen Bonding 结构特点 7 G 6 7 7 G 6 6 G 7 3 -30

G-quartet formation G-quartets in Vivo ? Telomeres Immunoglobulin switch regions HIV 1 RNA Fragile G-quartet formation G-quartets in Vivo ? Telomeres Immunoglobulin switch regions HIV 1 RNA Fragile X repeat Ribosomal DNA 3 -31

G-rich oligonucleotides or GROs : A new Cancer treatment 3 -32 G-rich oligonucleotides or GROs : A new Cancer treatment 3 -32

3 -33 3 -33

真核生物染色体端粒DNA结构 GGGGTTTGGG GTTT T T G G G G G T 5‘ T T 真核生物染色体端粒DNA结构 GGGGTTTGGG GTTT T T G G G G G T 5‘ T T 3‘ 3 -34

可能的功能 A 稳定真核生物染色体结构 5’-----TTAGGGTTAGGGT T A 3’-----AATCCC GGG Hoogsteen Bonding B 保证DNA末端准确复制 C 与DNA分子的组装有关 可能的功能 A 稳定真核生物染色体结构 5’-----TTAGGGTTAGGGT T A 3’-----AATCCC GGG Hoogsteen Bonding B 保证DNA末端准确复制 C 与DNA分子的组装有关 D 与染色体的减数分裂 meiosis & 有丝 分裂 mitosis 有关 3 -35

2. 1 Nucleic Acid Structure : RNA structure 1. Single stranded nucleic acid 2. 2. 1 Nucleic Acid Structure : RNA structure 1. Single stranded nucleic acid 2. Secondary structure are formed some time 3. Globular tertiary structure are important for many functional RNAs, such as t. RNA, r. RNA and ribozyme RNA Forces for secondary and tertiary structure: intramolecular hydrogen bonding and base stacking.

t. RNA Ribozyme RNA Secondary structure Tertiary structure t. RNA Ribozyme RNA Secondary structure Tertiary structure

Conformational variability of RNA is important for the much more diverse roles of RNA Conformational variability of RNA is important for the much more diverse roles of RNA in the cell, when compared to DNA. Structure and Function correspondence of protein and nucleic acids Protein Fibrous protein Globular protein Structural proteins Nucleic Acids Helical DNA Globular RNA • Enzymes, Genetic • Ribozymes information • Transfer RNA • antibodies, • receptors etc maintenance (t. RNA) • Signal recognition etc.

RNA结构特点及与DNA的区别 • • • 碱基组成不同; RNA分子中有许多稀有碱基; RNA分子中的戊糖是D-核糖,而DNA不是; RNA分子是多聚核苷酸单链; RNA分子中的碱基不严格遵守Chargaff法则; RNA分子在碱性溶液中敏感,易水解; RNA分子内只有部分双链区域; RNA分子是遗传信息的传递体; 某些RNA病毒,是以RNA分子作为遗传信息的载体; 核酶RNA分子具有催化功能; RNA结构特点及与DNA的区别 • • • 碱基组成不同; RNA分子中有许多稀有碱基; RNA分子中的戊糖是D-核糖,而DNA不是; RNA分子是多聚核苷酸单链; RNA分子中的碱基不严格遵守Chargaff法则; RNA分子在碱性溶液中敏感,易水解; RNA分子内只有部分双链区域; RNA分子是遗传信息的传递体; 某些RNA病毒,是以RNA分子作为遗传信息的载体; 核酶RNA分子具有催化功能;

细胞内RNA的分布 • 成熟的RNA主要分布在细胞质中。 • 主要分为三大类:转运RNA(t. RNA);信使 RNA(m. RNA);核蛋白体RNA(r. RNA)。 • 细胞核内的RNA(n. RNA),另一部分是核内 小RNA(sn. RNA)核不均一RNA(hn. 细胞内RNA的分布 • 成熟的RNA主要分布在细胞质中。 • 主要分为三大类:转运RNA(t. RNA);信使 RNA(m. RNA);核蛋白体RNA(r. RNA)。 • 细胞核内的RNA(n. RNA),另一部分是核内 小RNA(sn. RNA)核不均一RNA(hn. RNA), 转移-信使RNA(tm. RNA)si. RNA,mic. RNA。

细胞内总RNA 细胞中RNA的分布 编码RNA占 总量的4% hn. RNA m. RNA 非编码RNA占 总量的94% 非编码 r. RNA 前t. 细胞内总RNA 细胞中RNA的分布 编码RNA占 总量的4% hn. RNA m. RNA 非编码RNA占 总量的94% 非编码 r. RNA 前t. RNA r. RNA 所有生物 sn. RNA sno. RNA sc. RNA t. RNA 仅真核生物 仅细菌 tm. RNA

RNA的分类概述 1、m. RNA的结构 • m. RNA存在于细胞质,总量不到细胞总RNA 的5%; • 真核细胞m. RNA是单顺反子(monocistron); • 原核细胞是多顺反子(poly-cistron); UGA UAG RNA的分类概述 1、m. RNA的结构 • m. RNA存在于细胞质,总量不到细胞总RNA 的5%; • 真核细胞m. RNA是单顺反子(monocistron); • 原核细胞是多顺反子(poly-cistron); UGA UAG AUG m 7 G 5’ppp 5’Nm(Nm) 5’帽子 5’非编码区 AAUAAA 3’非编码区 (A)n. AAOH 3’poly A

● In Prokaryote m. RNA 5’-end; 300±Nt leading seq. (A/G-------AUG) Shine-Dalgarno seq. (S. D ● In Prokaryote m. RNA 5’-end; 300±Nt leading seq. (A/G-------AUG) Shine-Dalgarno seq. (S. D seq) GGAGG S. D seq-----------AUG 9 Nt better rich A, U, → G mut. translation go down poly-cistron

● In Eukaryote mono-cistron leading seq. 5’ m 7 Gppp--- -----CCACC-----A-3 ---A 1 U ● In Eukaryote mono-cistron leading seq. 5’ m 7 Gppp--- -----CCACC-----A-3 ---A 1 U 2 G 3 G 4— 核糖体小亚基扫描AUG 至关准确翻译 的信号序列 But m. RNA of chloroplast shows similarities to prokaryote type 1; S-D seq. with greater secondary structure in leading Seq. type 2; rich AU with little secondary structure in leading Seq. poly-cistron

2 t. RNA的结构 ● t. RNA含量较多,约占总细胞总RNA的15%; ● t. RNA由 74-95个核苷酸组成,通常为 76个; ● 微小 RNA, 2 t. RNA的结构 ● t. RNA含量较多,约占总细胞总RNA的15%; ● t. RNA由 74-95个核苷酸组成,通常为 76个; ● 微小 RNA, 沉降系数 4-4. 5 s, (74 -95 Nt) ● t. RNA phe, 77 Nt构成的三叶草型 (1964 Holly R. ) ● Nt 多被甲基化修饰, (含有稀有碱基组成的核 苷,如:假尿嘧啶核苷( ),二氢尿苷(D), 肌苷(I)等) ● 5 arms & 4 loops

t. RNA的二级结构特征 • 1、含有稀有碱基和稀有核苷酸,达核苷酸总量的 5-20%; • 2、3’端含有一个CCA序列,是所有t. RNA接受氨 基酰化的位置,它是t. RNA合成后加上的; • 3、所有的t. RNA分子形成三叶草的二级结构和L 型构象; t. RNA的二级结构特征 • 1、含有稀有碱基和稀有核苷酸,达核苷酸总量的 5-20%; • 2、3’端含有一个CCA序列,是所有t. RNA接受氨 基酰化的位置,它是t. RNA合成后加上的; • 3、所有的t. RNA分子形成三叶草的二级结构和L 型构象; • 4、t. RNA分子有5个臂和4个环;

5 副密码子 Paracodon 由若干Nt组成,存在于t. RNA不定位置上 与AARS侧链基团的分子发生特异的“契合” 成为t. RNA准确负载氨基酸的机制之一 6 t. RNA的”L” 三维结构与功能 “L”构型的结构力 二级结构中双链区的碱基堆积力和氢键 5 副密码子 Paracodon 由若干Nt组成,存在于t. RNA不定位置上 与AARS侧链基团的分子发生特异的“契合” 成为t. RNA准确负载氨基酸的机制之一 6 t. RNA的”L” 三维结构与功能 “L”构型的结构力 二级结构中双链区的碱基堆积力和氢键 二级结构中非双链区在“L”结构中,形成氢键结合

---aa accept arm ; loading aa at 3’ end ---TΨC loop; contact with 5 ---aa accept arm ; loading aa at 3’ end ---TΨC loop; contact with 5 s r. RNA ---DHU loop; contact with AARS ---anti-codon loop; 34 th is wobble base I type ; 3 -5 Nt 3/4 t. RNA II type ; 13 -21 Nt ---extra loop; classification marker ?

“L”结构域的功能 ---aa accept arm 位于“L”的一端,契合于核糖体的肽基 转移酶结合位点 P A, 以利肽键的形成。 ---anti-codon arm 位于”L”另一端,与结合在核糖体 小亚基上的codon of “L”结构域的功能 ---aa accept arm 位于“L”的一端,契合于核糖体的肽基 转移酶结合位点 P A, 以利肽键的形成。 ---anti-codon arm 位于”L”另一端,与结合在核糖体 小亚基上的codon of m. RNA配对。 A P aa’-t. RNAaa

“L”结构域的功能 --- TΨC loop & DHU loop T C loop 位于“L”两臂的交界处, Amino acid arm “L”结构域的功能 --- TΨC loop & DHU loop T C loop 位于“L”两臂的交界处, Amino acid arm 利于“L”结构的稳定 ---“L”结构中碱基堆积力大 使其结构趋于稳定 位于“L”结构末端 堆积力小 自由度大 使碱基配对摇摆 Anti-codon arm wobble base DHU loop extra loop

3. r. RNA的结构 • r. RNA是所有RNA中含量最多的一类,占细胞总RNA的80% 以上;与蛋白质结合存在。 • 核糖体由RNA和蛋白组成,真核细胞中 1: 1,原核细胞中 2: 1。 • 3. r. RNA的结构 • r. RNA是所有RNA中含量最多的一类,占细胞总RNA的80% 以上;与蛋白质结合存在。 • 核糖体由RNA和蛋白组成,真核细胞中 1: 1,原核细胞中 2: 1。 • r. RNA 中修饰碱基比t. RNA少,甲基化约占 2%。不同生物来 源的r. RNA(类 16 s,23 s)一级结构的某些区域具有高度的 序列同源性。 • r. RNA分子内有大量的茎环结构,使其具有多种构象,二级 结构十分复杂。 • r. RNA的结构在蛋白质合成中,随着m. RNA和t. RNA的结合及 亚基蛋白分子的组装将发生改变,r. RNA的二级结构始终处 于动态的变化中。

● Prokaryote 23 s, 16 s, 5 s / Eukaryote 28 s-5. 8 s, ● Prokaryote 23 s, 16 s, 5 s / Eukaryote 28 s-5. 8 s, 18 s, 5 s ● Rich methylation (m 2 U, m 3 A, m 3 U, m 26 A(二甲基)…)

Two-dimensional gel electrophoresis of proteins(蛋白二维电泳) (a) E. coil 30 S subunits 21 proteins (b) Two-dimensional gel electrophoresis of proteins(蛋白二维电泳) (a) E. coil 30 S subunits 21 proteins (b) E. coil 50 S subunits. Kaltschmidt & Wittmann PNAS 67 (1970) f. 1 -2, pp. 1277 -78. ) 31 proteins

● 5 s RNA 与TΨC loop of t. RNA部分同源,并可配对 ● In Prok. 5 s ● 5 s RNA 与TΨC loop of t. RNA部分同源,并可配对 ● In Prok. 5 s RNA 121 nt 与23 s r. RNA 组成大亚基 ● In Prok. 16 s RNA 1542 nt 与大亚基组成核糖体 3’-end of 16 s r. RNA rich CCU conservative seq. complementary with 5’ leading seq. of m. RNA Shine-Dilgarno seq. of rich AGG ● In Prok. t. RNA 核糖体r. RNA,m. RNA之间的 相互关系如何?

● 23 s r. RNA --- 2904 nt 6 domains ---有的与对抗生素的抗性有关 ---2660±Nt region α-I ● 23 s r. RNA --- 2904 nt 6 domains ---有的与对抗生素的抗性有关 ---2660±Nt region α-I loop(alpha Sarcine ) binding with complex of aa-t. RNAaa~(EF)-Tu~GTP G 2661 C , aa-t. RNAaa into A site go down ---G 2252, G 2253双突变为C, 将对转肽酶的活性产生抑制

● In Euk. 3’-end of 18 s r. RNA 与原核生物高度相似, 但无与 S. D. seq. ● In Euk. 3’-end of 18 s r. RNA 与原核生物高度相似, 但无与 S. D. seq. 互补的保守序列 在 m. RNA的AUG上游存在CCACC核糖体scanning seq 成为核糖体识别第一个 AUG的信号 Shine-Dalgarno seq. (S. D seq) GGAGG Bacterial ME ME A A CCUGCGGUUGGAUGACCUCCUU 16 S Mammalian 18 sr. RNA AMEAMECCUGCGGAAGGAUGAUUA 高度相似

● In Euk. 大亚基由 28 s r. RNA 4718 nt , 5. 8 s ● In Euk. 大亚基由 28 s r. RNA 4718 nt , 5. 8 s r. RNA 158 nt 5 s r. RNA 120 nt 与45种蛋白构成; 小亚基由 18 s r. RNA 1874 nt r. RNA与30种蛋白构成。 特点:修饰碱基比t. RNA少; 二级结构复杂; 5 s. RNA一级结构序列比其它r. RNA保守 性高; r. RNA的构象处于不断的动态变化中;

● More hairpin structue ● More hairpin structue

4. sn. RNA • 真核细胞核内特有sn. RNA, 存在于细胞核内或 核质及核仁中,在基因转录加 过程中具有 重要作用; • sn. RNA含有70-300 nt,不是任何RNA前体; 4. sn. RNA • 真核细胞核内特有sn. RNA, 存在于细胞核内或 核质及核仁中,在基因转录加 过程中具有 重要作用; • sn. RNA含有70-300 nt,不是任何RNA前体; • sn. RNA有20多种其中 13中富含U,占分子内 的35%。U 1,U 2,U 3在真核细胞转录中对 hn. RNA的加 是必需的; • sn. RNA通常是与蛋白质结合形成核蛋白体( sn. RNP)复合物发挥作用;

5. sno. RNA ( small nucleolar RNA) • 核仁小分子RNA广泛分布于酵母和真核细胞的核仁 区; • 哺乳动物细胞的sno. RNA以U命名,酵母的以sn. R命 5. sno. RNA ( small nucleolar RNA) • 核仁小分子RNA广泛分布于酵母和真核细胞的核仁 区; • 哺乳动物细胞的sno. RNA以U命名,酵母的以sn. R命 名 • 根据结构比较,将其分为两类:①box. C/D型: 5’端 含有box. C(UGAUGA)序列,3’端有box. D (CUGA), 在box. D上游有8-14 nt与r. RNA内的保守核心序列互 补;②box. H/ACA型:其 3’端第三个核苷酸上游有 一个保守的ACA或类似序列AGA,AUA。整个分 子形成两个发卡结构中间是保守的box. H(ANANNA) 的铰链区。

 • 功能: 1. 作为r. RNA前体加 复合体的重要组分, 参与r. RNA前体的加 。 2. 参与r. RNA 2’-O-核糖的甲基化修饰。 • 功能: 1. 作为r. RNA前体加 复合体的重要组分, 参与r. RNA前体的加 。 2. 参与r. RNA 2’-O-核糖的甲基化修饰。 3. 参与部分sn. RNA t. RNA的甲基化修饰。 4. box. H/ACA型能指导r. RNA中的嘧啶向假 尿嘧啶的转换。

6. 非编码RNA • 近年来发现的一类非编码RNA。 • 不具有ORF。 • 功能:主要参与胚胎发育、肿瘤形成和抑 制、细胞生长和分化、染色体失活等。 6. 非编码RNA • 近年来发现的一类非编码RNA。 • 不具有ORF。 • 功能:主要参与胚胎发育、肿瘤形成和抑 制、细胞生长和分化、染色体失活等。

C. Properties of nucleic acids C 1 Nucleic Acid Structure : Modified Nucleic Acids C. Properties of nucleic acids C 1 Nucleic Acid Structure : Modified Nucleic Acids Modifications correspond to numbers of specific roles. We will discuss them in some related topics. For example, methylation of A and C to can avoid restriction digestion of endogenous DNA sequence

2. 2 Chemical and Physical Properties of Nucleic Acids 1. Stability of Nucleic Acids 2. 2 Chemical and Physical Properties of Nucleic Acids 1. Stability of Nucleic Acids 2. Effect of Acid & applications 3. Effect of alkali & applications Chemical properties 4. Chemical denaturation 5. Viscosity & applications 6. Buorant density & application Physical properties

Stability of Nucleic Acids 1. Hydrogen bonding • • Does not normally contribute the Stability of Nucleic Acids 1. Hydrogen bonding • • Does not normally contribute the stability of nucleic acids or protein Contributes to specific structures of these macromolecules. For example, a-helix, b-sheet, DNA double helix, RNA secondary structure 2. Stacking interaction/hydrophobic interaction between aromatic base pairs/bases contribute to the stability of nucleic acids. • It is energetically favorable for the hydrophobic bases to exclude waters and stack on top of each other • This stacking is maximized in double-stranded DNA Fig

Effect of Acid Strong acid + high temperature: completely hydrolyzed to bases, riboses/deoxyrobose, and Effect of Acid Strong acid + high temperature: completely hydrolyzed to bases, riboses/deoxyrobose, and phosphate p. H 3 -4 : apurinic nucleic acids (嘌呤核酸) [glycosylic bonds attaching purine (A and G) bases to the ribose ring are broken ], can be generated by formic acid (甲酸)

Effect of Alkali & Application 1. High p. H (> 7 -8) has subtle Effect of Alkali & Application 1. High p. H (> 7 -8) has subtle (small) effects on DNA structure 2. High p. H changes the tautomeric (互变异构)state of the bases keto form enolate form Base pairing is not stable anymore because of the change of tautomeric states of the bases, resulting in DNA denaturation

C. Properties of nucleic acids RNA hydrolyzes at higher p. H because of 2’-OH C. Properties of nucleic acids RNA hydrolyzes at higher p. H because of 2’-OH groups in RNA 2’, 3’-cyclic phosphodiester alkali RNA is unstable at higher p. H OH free 5’-OH

Chemical Denaturation Urea (H 2 NCONH 2) (尿素): denaturing PAGE Formamide (HCONH 2) (甲酰胺): Chemical Denaturation Urea (H 2 NCONH 2) (尿素): denaturing PAGE Formamide (HCONH 2) (甲酰胺): Northern blot Disrupting the hydrogen bonding of the bulk water solution Hydrophobic effect (aromatic bases) is reduced Denaturation of strands in double helical structure

Viscosity(粘性) Reasons for the DNA high viscosity 1. High axial ratio 2. Relatively stiff Viscosity(粘性) Reasons for the DNA high viscosity 1. High axial ratio 2. Relatively stiff Applications: Long DNA molecules can easily be shortened by shearing force. Remember to avoid shearing problem when isolating very large DNA molecule.

Buoyant density (DNA的浮力密度) 1. 7 g cm-3, a similar density to 8 M Cs. Buoyant density (DNA的浮力密度) 1. 7 g cm-3, a similar density to 8 M Cs. Cl Purifications of DNA: equilibrium density gradient centrifugation Protein floats RNA pellets at the bottom back

2. 3 Spectroscopic and Thermal Properties of Nucleic Acids 1. UV absorption: • • 2. 3 Spectroscopic and Thermal Properties of Nucleic Acids 1. UV absorption: • • • nucleic acids absorb UV light due to the aromatic bases The wavelength of maximum absorption by both DNA and RNA is 260 nm (lmax = 260 nm) Applications: detection, quantitation, assessment of purity (A 260/A 280) 2. Hypochromicity(减色效应): caused by the fixing of the bases in a hydrophobic environment by stacking, which makes these bases less accessible to UV absorption. ds. DNA, ss. DNA/RNA, nucleotide

3. Quantitation of nucleic acids Extinction coefficients: 1 mg/ml ds. DNA has an A 3. Quantitation of nucleic acids Extinction coefficients: 1 mg/ml ds. DNA has an A 260 of 20 ss. DNA and RNA, 25 The values for ss. DNA and RNA are approximate (1) The values are the sum of absorbance contributed by the different bases (e : purines > pyrimidines) (2) The absorbance values also depend on the amount of secondary structures due to hypochromicity. 4. Purity of DNA A 260/A 280: ds. DNA--1. 8 pure RNA--2. 0 protein--0. 5

5. Thermal denaturation/melting: heating leads to the destruction of double-stranded hydrogen-bonded regions of DNA 5. Thermal denaturation/melting: heating leads to the destruction of double-stranded hydrogen-bonded regions of DNA and RNA: the absorbance increases gradually and irregularly DNA: the absorbance increases cooperatively. melting temperature (Tm): the temperature at which 40% increase in absorbance is achieved. back

Concentration 50μg/ml OD Opetical Density d. NTPs A 260 = 1. 60 1. 37 Concentration 50μg/ml OD Opetical Density d. NTPs A 260 = 1. 60 1. 37 S. S DNA A 260 = 1. 37 D. S DNA A 260 = 1 1. 0 ℃ Tm (melting temperature) temperature range over which DNA is = midpoint of the denatured 3 -75

6. Renaturation: Rapid cooling: only allow the formation of local base paring. Absorbance is 6. Renaturation: Rapid cooling: only allow the formation of local base paring. Absorbance is slightly decreased Slow cooling: whole complementation of ds. DNA. Absorbance decreases greatly and cooperatively. Fig. 2. Annealing: base paring of short regions of complementarity within or between DNA strands. (example: annealing step in PCR reaction) Hybridization: renaturation of complementary sequences between different nucleic acid molecules. (examples: Northern or Southern hybridization)

3. 7. 2. 1 DNA复性的必要条件: ①、一定的离子强度 Na+可以中和磷酸基团的负电荷产生的排 斥力 ②、较高的温度 维持合适的温度是必须的,温度太低,易产生错 配,太高难以形成氢键。 3 -77 3. 7. 2. 1 DNA复性的必要条件: ①、一定的离子强度 Na+可以中和磷酸基团的负电荷产生的排 斥力 ②、较高的温度 维持合适的温度是必须的,温度太低,易产生错 配,太高难以形成氢键。 3 -77

 3. 7. 2. 2 影响DNA复性过程的因素 : ① 阳离子浓度 0. 15 ~ 0. 5 3. 7. 2. 2 影响DNA复性过程的因素 : ① 阳离子浓度 0. 15 ~ 0. 5 M Na+ 可消除polyd. Nt 间的静电斥力 ② 复性反应的温度 Tm - 25℃ (60 -65℃) 以消除S. S. DNA 分子内的部分二级结构 ③ S. S. DNA分子的长度 S. S. DNA愈长→ 分子扩散愈慢→ 复性愈慢 S. S. DNA愈短→ 分子扩散愈快→ 复性愈快 3 -78

 影响DNA复性过程的因素 : ④ S. S, DNA 的初始浓度 C 0 同一种 DNA分子浓度越 高,复性越快。 ⑤ 影响DNA复性过程的因素 : ④ S. S, DNA 的初始浓度 C 0 同一种 DNA分子浓度越 高,复性越快。 ⑤ DNA分子中, d. Nt的排列 状况 (随机排列, 重复排列) DNA的复杂性,简单分子易复性,复杂分子复性难 3 -79

 1 3500 1. 7× 105 4. 2× 106 bp K. C. 2× 10 1 3500 1. 7× 105 4. 2× 106 bp K. C. 2× 10 -6 8× 10 -3 3× 10 -1 9 Cot 1/2 3 -80

 • 复性速度常数K 2与DNA的复杂性成反比。 • Cot(1/2)越高,DNA越复杂。 • 利用C/Co值和Cot作图就可以求出Cot(1/2)值。 • 复性程度的检测方法 ①羟基磷灰石柱层析 ②测定S 1核酸梅水解DNA的量 ③测定增色效应 • 复性速度常数K 2与DNA的复杂性成反比。 • Cot(1/2)越高,DNA越复杂。 • 利用C/Co值和Cot作图就可以求出Cot(1/2)值。 • 复性程度的检测方法 ①羟基磷灰石柱层析 ②测定S 1核酸梅水解DNA的量 ③测定增色效应 3 -81

DNA Supercoiling Closed circular molecule Supercoiling & energy Topoisomer & topoisomerase DNA Supercoiling Closed circular molecule Supercoiling & energy Topoisomer & topoisomerase

1. Almost all DNA molecules in cells can be considered as circular, and are 1. Almost all DNA molecules in cells can be considered as circular, and are on average negatively supercoiled. Counter helical turn

2. Negative supercoiled DNA has a higher torsional (扭 转的) energy than relaxed DNA, 2. Negative supercoiled DNA has a higher torsional (扭 转的) energy than relaxed DNA, which facilitates the unwinding of the helix, such as during transcription initiation or replication 3. Topoisomer: A circular ds. DNA molecule with a specific linking number which may not be changed without first breaking one or both strands.

Supercoiled structure of circular DNA molecules with low writhe. Note that the helical nature Supercoiled structure of circular DNA molecules with low writhe. Note that the helical nature of the DNA duplex is omitted for clarity.

Supercoiled structure of linear DNA molecules with constrained ends. Note that the helical nature Supercoiled structure of linear DNA molecules with constrained ends. Note that the helical nature of the DNA duplex is omitted for clarity.

Topoisomerases exist in cell to regulate the level of supercoiling of DNA molecules. Type Topoisomerases exist in cell to regulate the level of supercoiling of DNA molecules. Type I topoisomerase: breaks one strand change the linking number in steps of ± 1. Type. II topoisomerase: breaks both strands and change the linking number in steps of ± 2. Gyrase(促旋酶): introduce the negative supercoiling (resolving the positive one and using the energy from ATP hydrolysis.

Ethidium bromide (intercalator): locally unwinding of bound DNA, resulting in a reduction in twist Ethidium bromide (intercalator): locally unwinding of bound DNA, resulting in a reduction in twist and increase in writhe. Topoisomerases Type I: break one strand of the DNA , and change the linking number in steps of ± 1. Type II: break both strands of the DNA , and change the linking number in steps of ± 2.