Boala von Willebrand Robert Gosselin MT ASCP CLS

Boala von Willebrand Robert Gosselin MT (ASCP), CLS

Boala von Willebrand (BVW): diagnoză bazată pe simptome şi principii directoare privind tratarea, Institutul Naţional pentru Inimă, Plămâni şi Sânge (NHLBI) Raport Specializat (SUA) (Hemofilia 2008; 14: 171 -232) Analiza Factorului von Willebrand: Ghid – Ediţia a II-a (H 51 -2) (în curs de desfăşurare)

În 1924 Erik von Willebrand a evaluat o fetiţă de 5 ani cu diateză hemoragică şi ca rezultat cei 66 membri ai familiei de pe coasta Finlandei şi a constatat: – Hemoragii mucocutanate – Patologie moştenită autosomal – Sângerări prelungite – Timp normal de coagulare – Nu este corectat cu transfuzii de sânge

În 1950 deficienţa proteinei în plasmă a cauzat hemoragii prelungite A fost considerată “Factorul von Willebrand” O dată cu producerea crioprecipitatului şi a concentraţiilor Factorului 8, s-a constatat că acestea s-au complicat împreună

FVW este produs în celulele endoteliale – sintetizat şi păstrat în corpusculii Weibel-Palade megacariocite – stocate în granulele alpha Se constituie din subunităţi identice pentru a forma şiruri lineare multimeri formaţi în complexul Golgi

În timpul circulaţiei, FVW este conjugat cu F 8 Pe leziune, FVW este supus unei modificări corespunzătoare şi aderă la ţesutul subendotelial sub influenţa unor condiţii limitate Plachetele aderă via GPIb-IX Timpul de înjumătăţire este de ~12 ore

Multimerii FVW – Degradare datorită ADAMTS 13 [Disintegrin şi Metaloproteinază cu Trombo. Spondin de tipul 1, membrul 13] Deficienţa ADAMTS 13 a fost asociată cu TTP

Funcţiile FVW Hemophilia 2008; 14: 177

Boala von Willebrand Deficienţa proteinei în plasmă a factorului von Willebrand (Fv. W) – Deficienţă cantitativă • Deficienţă parţială de tip I • Deficienţă totală de tip III – Deficienţă calitativă (de tip II) • Anomalie funcţională Braţ scurt al cromozomului 12

Tipurile de Boală Von Willebrand • Tipul 1 -autosomal dominant • Tipul 2 -autosomal dominant – 2 A (autosomal recesiv) – 2 B – 2 M – 2 N (autosomal recesiv) • Tipul 3 (autosomal recesiv) • Pseudo-BVW-autosomal dominant • BVW dobândită

Proteina Fv. WGenă/m. RNA/Domenii funcţionale

Boala von Willebrand 1% din populaţie cu Fv. W – 125/1, 000 suferă de hemoragii semnificative – În Marea Britanie, 6294 au înregistrat pacienţi diagnosticaţi cu Bv. W, doar 10% au beneficiat de tratament în decursul anului 2001 Tipul I numără ~75% din toate Bv. W Dx De la stare uşoară la gravă – Hx • • Tendinţă de a face vânătăi foarte uşor Hemoragii nazale Hemoragii gingivale Menoragii Variabilitatea Hemoragiei – De la uşoară la gravă

Terminologie • BVW – boala von Willebrand • FVW – proteină von Willebrand matură • FVW: RCo – activitatea cofactorului ristocetină, ce măsoară activitatea proteinei Fv. W** • FVW: Ag – antigenul FVW • FVW: CB – analiza legăturii de colagen, o altă componentă a funcţiei Fv. W • FVIII: C – activitatea factorului VIII • FVW: FVIIIB - Fv. W- analiza legăturii factorului VIII • RIPA – agregarea plachetară indusă a ristocetinei • FVWpp – propeptida Fv. W Hemophilia 2008; 14: 177

Testele de Laborator privind Bv. W şi deficienţa PLT

Testul de bază (recomandat pentru primul strat) – Testele Screening • PT şi a. PTT • PFA (Siemens)* sau Testarea trombocitelor (Laboratoarele Helena)* • Timpul FĂRĂ sângerare – FVW: RCo – măsoară activitatea • Ristocetinei induse • Ristocetinei independente – FVW: Ag – măsoară proteina • Proporţia FVW: RCo/FVW: Ag – F 8 – la r/o tipul 2 N * Pot lipsi anumite subtipuri de BVW

Stratul al doilea (următor) – Analiza multimerilor – în cadrul tipului 2 suspectat – Agregarea ristocetinei • Doză mică (0. 6 mg/ml) – FVW: CBA – în cadrul tipului 2 suspectat – FVWpp – în variantele tipului 1 suspectat – Altele • DDAVP (desmopresin) – IV sau nazal • Analiză moleculară • Anticorpi – Dobândit

Factorii ce afectează nivelele FVW – Practicarea sportului – Stresul • Psihologic • Fiziologic – Timpul prelungit de aplicare a bandajului de compresie – Dietă? ? – Altele • Graviditate, contraceptive orale, HRT • Traume • Procese inflamatorii

Alţi factori ce influenţează nivelele FVW – Tipul mostrei • Este preferat citrat de sodiu de 3. 2% – Media FVW: Ag în grupa de sânge** • • Grupa O: 75 (36 -157) Grupa A: 106 (48 -234) Grupa B: 117 (57 -241) Grupa AB: 123 (64 -238) – Utilizarea filtrelor pentru a obţine PPP ** Hemophilia 2008; 14: 177

Anticorpul anti-uman conjugat al FVW (+) Spălare Micro rezervor ce conţine anti-FVW + Incubare Test Chromogenic Spălare ¤ ¤ ¤ ++ + ¤ ¤ ¤ ¤ + + + Incubare Testele ELISA şi LIA Colorare Cantitatea de culoare trebuie să fie proporţională cantităţii de anticorpi prezenţi Reagenţi acoperiţi cu anti. Fv. W al pacientului Rezervorul de testare Incubare Citirea instrumentului — modificări în densitatea optică secundare agregatelor

Rezultatele în comparaţie cu curba Std Testele de aglutinare şi agregare a trombocitelor Plasma pacientului + Ristocetină1. 2 mg/m. L (l) & 0. 6 mg/m. L (r) Trombocitele şi plasma pacientului + Ristocetină Zhou and Schmaier Am J Clin Pathol 2005; 123: 172 -183 Rezultatele în comparaţie cu restul populaţiei

FVW: RCo • Plasmă săracă în trombocite • Trombocite consolidate – Pregătite pentru a fi utilizate – Pot fi combinate cu ristocetină • Ristocetină – Iniţial utilizată în calitate de antibiotic – Peptide din Amycolatopsis lurida – Considerată că contribuie la apariţia efectelor mimice ca rezultat al unui stres puternic

Probleme legate de FVW: RCo Variabilitate – Dintre multitudinea de ristocetine – Dintre metodele reagenţilor Gradul de imprecizie nu este absolut (de la 15%) Nivel scăzut de sensibilitate – Utilizarea metodelor automatizate la nivel redus 15 -20%

Activitatea FVW Ristocetina independentă • Plasmă săracă în trombocite • Particule polimerice Latex acoperite cu anticorp monoclonal (anti-GPIb) – Determină domeniul funcţional al FVW • Metodele LIA şi ELISA • Poate reduce variabilitatea asociată cu FVW: RCo

IL FVW: Act versus Siemens FVW: RCO

IL FVW: Act versus Siemens FVW: RCo

FVW: RCo versus RIPA FVW: RCo Măsoară activitatea Fv. W PLT exogene Ristocetină exogenă Aglutinarea trombocitelor Metodele ELISA (FVW: Act) Metodele LIA (FVW: Act) RIPA Măsoară interacţiunea dintre Fv. W şi trombocitele GP Plasma pacienţilor Trombocitele pacienţilor Ristocetină exogenă Agregarea trombocitelor Fv. W: RCo măsoară doar plasma Fv. W, în timp ce RIPA măsoară atât plasma Fv. W, cât şi interacţiunea dintre Fv. W şi trombocite

FVW: Ag • Majoritatea laboratoarelor utilizează sau testul ELISA, sau testul LIA – Testul ELISA … ore – Testul LIA … minute • Metoda tradiţională este electroforeza pe gel • Mai puţină variabilitate decât la FVW: RCo • Posibile efecte în “pre-zonă” sub influenţa metodelor automatizate (LIA) • Testul poate fi aplicat şi la alte indicaţii – Vasculita Rx

FVW: CB • Metoda ELISA – Trombocite acoperite cu colagen de tip I sau tip III – Sursa ecvino-bovină – Corelare mai bună cu greutate moleculară mare (HMW) a Fv. W – Capacitate de re-producere mai bună decât la Fv. W: Rco • Detectare îmbunătăţită la nivele inferioare – Neaprobat de către Administraţia Alimentelor şi Medicamentelor din SUA • Păcat!!!

Analiza legăturii de colagen Raport : Fv. W: Ag la Fv. W: CB Favaloro, Am J Clin Pathol 2000; 608 -618 Type 1 VWD Type 2 VWD

Analiza multimerică a Fv. W de tip II Favaloro, Thromb Haemost 2007; 98: 346 -358

Propeptida Fv. W (Fv. W: pp) • Stocat în granule α sau corpusculi Weibel. Palade • În urma secreţiei în plasmă, t½: 2 -3 ore – versus Fv. W matur t½: ~10 ore • Concentraţiile plasmei ~1μg/m. L – versus Fv. W matur: 10 μg/m. L • Studiile efectuate indică: – Raportul Fv. W: pp mărite la Fv. W: Ag cu deficienţă genetică redusă a Fv. W: Ag cu supravieţuire Fv. W – Supravieţuirea Fv. W ar sugera de asemenea strategii alternative Rx

Pseudo-BVW • Similară tipului 2 – Număr redus de trombocite – “Are avantaje în funcţie” • Agregare cu doză mică de ristocetină – Trebuie să efectueze FVW: PB • Mărit faţă de BVW: 2 B • Normal cu psuedo-BVW – Receptor GPIb anormal

From M Ledford-Kramer, Editor Clot-Ed

Ghidul CLSI H 51 -2 • Recomandări referitor la – Tipul mostrei, procesare – Testare – Calibrare şi raportare a rezultatelor • • Aceeaşi calibrare pentru FVW: Act şi FVW: Ag Calibrare diferenţiată pentru terapeutică Unităţi Proporţii – Propuneri privind Implementarea/validarea ? ? • Implementarea noii metode • Lot-la-lot

Bv. W de tip I • Hx semnificativ pentru hemoragiile mucocutanate • • Fv. W: RCo, Fv. W: CB, Fv. W: Ag sunt <50 IU/ml Raportul Fv. W: RCo/Fv. W: Ag >0. 7 Numărul de PLT (trombocite) Normal Analiza multimerică normală Activitatea Factorului VIII normal/ RIPA e redusă PFA C. T. ca regulă , BT puţin mai bine decât “moneda” • Supravieţuirea proptidelor? ?

Bv. W de tip 2 A • Variantă limitată cu funcţia PLT-dependente în absenţa multimerilor de greutate moleculară mare • Două tipuri de mutaţii – Grupul 1: circulaţie deficitară intracelulară, reţinere a multimerilor considerabili în ER – Grupul 2: susceptabilitate mărită la proteoliza Fv. W, multimeri largi • Malinterpretare, ştergeri, inserări • Anamneză clinică (personală sau familială) hemoragie (mucosal)

Bv. W de tip 2 A • Constatările de Laborator – Număr de PLT Normal – Fv. W: RCo scăzut – Fv. W: CB redus – Activitatea factorului VIII normală/ – Fv. W: Ag ca regulă normal/ • Raportul Fv. W: Rco sau v. WF: CBA la v. WF: Ag este <0. 7 – RIPA este redusă • PFA C. T. de obicei – Absenţa multimerilor cu greutate moleculară mare

Bv. W de tip 2 B • Variantă modificată cu “avantaj în funcţie” • Afinitate crescută pentru Gp. Ib plachetară • 4 mutaţii (substituiri nucleotide) în cadrul Fv. WA 1 ce numără ~90% de tip IIb • Parametri de laborator similari ca şi în cazul pseudo - Bv. W • Anamneză clinică (personală sau familială) hemoragie (mucosal)

Bv. W de Tip 2 B • Constatările de laborator – – – Numărul PLT este de la normal la scăzut Fv. W: RCo este redus (de obicei) Fv. W: CBA este scăzut (de obicei) Activitatea factorului VIII este normală/ Fv. W: Ag este ca regulă normal/ • Raportul Fv. W: Rco sau Fv. W: CBA la v. WF: Ag este <0. 7 – RIPA este • Doză mică de ristocetină (0. 75 mg/m. L) • PFA---normal la – Absenţa multimerilor cu greutate moleculară mare

Pseudo- Bv. W • Mutaţii în complexul Gp. Ib-IX la nivel plachetar • Manifestări clinice variabile ale Hemoragiei • Parametri de laborator similari ca şi în cazul tipului 2 B: – Trombocitopenie variabilă – RIPA mărit – Număr redus de multimeri cu greutatea moleculară mare

Constatările de laborator diferenţiate: Tipul IIb versus Pseudo-Bv. W • Cantitatea normală de PLT în cazul mostrei tipului IIb: – RIPA mărită • Cantitatea normală de Crioprecipitat în cazul pseudo-Bv. W – Agregare spontană Testarea FVW: PB se preferă definitivă

Bv. W de tip 2 M • Variantă modificată prin funcţia PLTdependente fără absenţa multimerilor cu greutate moleculară mare • Malinterpretare, ştergeri ale structurilor mici • Anamneză clinică (personală sau familială) hemoragie (mucosal)

Bv. W de Tip 2 M • Constatările de laborator – – – Numărul de PLT este normal Fv. W: RCo este scăzut Fv. W: CBA este redus Activitatea factorului VIII este normală/ Fv. W: Ag de obicei este normală/ • Raportul Fv. W: Rco sau Fv. W: CBA la Fv. W: Ag este <0. 7 – RIPA is redusă • PFA C. T. este ca regulă – Prezenţa multimerilor cu greutate moleculară mare • Pot fi observate cantităţi mărite

Bv. W de Tip 2 N • Deficienţă calitativă ce rezultă în conjugare redusă dintre Fv. W: FVIII • Autosomal recesivă • Heterozigoţi cu factor VIII normal • Hemoragia Hx legată de intervenţie chirurgicală sau trauma

Bv. W de Tip 2 N • Constatările de laborator – – Numărul de PLT e normal cu a. PTT prelungit Fv. W: RCo este normal Fv. W: CBA este normal Activitatea factor VIII e (de obicei între 5 -30 IU/ml) • Conjugare redusă dintre Fv. W: FVIIIC – Fv. W: Ag e normal • Raportul Fv. W: RCo sau Fv. W: CBA la Fv. W: Ag este >0. 8 – RIPA este normală • PFA C. T. e normal – Structura multimerului este normală

Bv. W de Tip III • Absenţă virtuală a proteinei Fv. W • Apariţie timpurie în timpul vieţii • Mutaţii multiple, inclusiv modificări de structură şi mutaţii lipsite de sens, precum şi ştergeri

Bv. W de Tip III • Constatările de laborator – a. PTT prelungit – Absenţa Fv. W: RCo – Absenţa Fv. W: CBA – Activitatea factorului VIII este considerabil – Absenţa Fv. W: Ag – RIPA este deosebit de anormală • PFA C. T. e considerabil de anormal – Structurile de multimeri sunt nedetectabile