БИОХИМИЯ КРОВИ II А И Артюхина Вол ГМУ

БИОХИМИЯ КРОВИ II А. И. Артюхина Вол. ГМУ

План n n n Стадии системы гемостаза Гемостатический баланс Факторы системы свертывания крови Внешний путь свертывания крови Внутренний путь свертывания крови Каскадный механизм активации ферментов Тромбоциты, роль в свертывании крови Этапы образования фибринового тромба, роль витамина К Система фибринолиза, система противосвертывания Фибринолитический процесс Особенности гемостаза у новорожденных Гемофилия

Система гемостаза защитная система организма, обеспечивающая сохранение крови в жидком состоянии в пределах кровеносных сосудов и образование тромбов в области повреждения стенки сосудов. Гемостатический процесс может быть подразделён на пять стадий: 1) локальная вазоконстрикция; n 2) формирование тромбоцитарного тромба, n 3) стабилизация его фибрином n 4) ретракция тромба n 5) его растворение после восстановления повреждённой стенки сосуда.

Гемостатический баланс за счет компенсаторного взаимодействия система гемостаза поддерживает кровь в жидком состоянии в течение всей жизни, в то же время при повреждении кровь быстро сворачивается, купируя кровотечение. При смещении гемостатического баланса за рамки физиологических норм возникают условия для развития патологических кровотечений или тромбозов

Гемостаз: Повреждение Тканевые факторы Нервная система Сосуды Тромбоциты Свертывание Сокращение Активация Ограничение кровотока Агрегация Первичный тромб Фибриновый тромб Тромбин Фибрин

Основные компоненты системы свёртывания крови были идентифицированы к середине 50 -х годов. Называли по фамилиям больных или по предполагаемому характеру выполняемой функции. В 1957 г Международный комитет по номенклатуре факторов свёртывания крови ввёл цифровые обозначения: плазменные факторы свёртывания были пронумерованы римскими цифрами, а тромбоцитарные – арабскими, активированные формы факторов обозначаются добавлением к цифре буквы «а»

Факторы системы свёртывания крови

Сериновыми протеазами являются активированные факторы II, VII, IX, X, XII, ПК n Протеазные домены – С-концевые части молекул проферментов (а/к последовательности этих участков факторов свёртывания крови гомологичны таковым трипсина и химотрипсина). Селективность действия протеаз системы гемостаза обеспечивается специфическими структурами N-концевых частей молекул. Каскад завершается образованием мономеров фибрина и последующим формированием тромба. n Трансглютаминаза - фактор XIII. n Кофакторы - факторы V, VIII, ВМК. Протеолитическая активация факторов гемостаза

Активация свёртывания крови Два типа взаимодействий могут приводить к инициации свёртывания крови. Каскад реакций гемокоагуляции принято представлять в виде двух возможных путей активации – внутреннего и внешнего Внешний путь (прокоагулянтный) для остановки кровотечения из капилляров и сосудов включается тканевым фактором, который в норме в крови и клетках, контактирующих с кровью, отсутствует и появляется при повреждении ткани

Внешний путь (прокоагулянтный) n n Повреждение эндотелиальных клеток Тканевой фактор – (апопротеин. III+фосфатидилсер ин) конститутивный Компонент мембран ряда типов клеток (кора головного мозга, миокард, клеток эпидермиса и эпителия, выстилающего cлизистые оболочки органов) Трансмембранный гликопротеин выполняет функции рецептора фактора УII и модулятора его активности. Кофакторная активность тканевого фактора определяется как апобелком, так и ФЛ мембраны клеток. Освобождение Тканевой фактор Ca 2+ Factor VII Тканевой тромбопластин (фактор III)

Тканевой фактор (ТФ) Связывание одноцепочечной формы фактора УII с ТФ изменяет структуру фактора УII и становится возможным его расщепление на двухцепочечную форму, которая в комплексе с ТФ активирует Х и IХ факторы свёртывания крови, что инициирует каскад реакций гемокоагуляции. n n Образование комплекса фактор УII-тканевой фактор резко увеличивает чувствительность фактора УII к протеолитической активации ( расщепляется связь Арг 152 -Иле 153). n Активация фактора УII - под действием следов активных форм факторов Х и 1 Х и в результате аутоактивации.

Внутренний путь (контактный) все компоненты присутствуют в крови начинается с контактной активации фактора ХII и прекалликреина. n Связывание фактора ХII с компонентами субэндотелиального слоя, активированными тромбоцитами, мицеллами фосфолипидами или бактериальными липополисахаридами изменяют его конформацию т. о. , что: 1) он становится высокочувствительным к протеолитической активации калликреином; 2) в комплексе с высокомолекулярным кининогеном повышает активацию прекалликреина, который затем может обеспечить дополнительную активацию фактора ХII. Коллаген субэндотелия n n Активация проэнзимов Ca 2+ PF-3 Тромбоцитарный тромбопластин (кислые фосфолипиды мембраны тромбоцитов ФС, ФИ и ФЭ)

Внутренний путь (контактный) n Активация фактора ХII: расщепление по остатку Арг 353 с образованием фермента, состоящего из двух п/п цепей, соединенных дисульфидным мостиком ( лёгкая цепь – обладает протеазной активностью, тяжёлая содержит домены для взаимодействия с другими компонентами). Калликреин плазмы может далее расщеплять ещё две связи по остаткам Арг 334, Арг 343, что приводит к образованию β-формы фактора ХIIа (ферментативно активна, но неспособна взаимодействовать с поверхностью и активировать фактор ХI).

Общий каскад реакций Активация фактора Х под действием фактора IХа протекает на поверхности Factor Тромбопластин фосфолипидов при участии ионов Са 2+и фактора VIIIа, выполняющего роль X матрицы, обеспечивающий связывание и оптимальное взаимодействие факторов IХа и Х, что увеличивает скорость реакции в сотни раз. Фактор Х состоит из Протромбиназа 2 -х цепочек, соединенных –S-S-мостиком Активация фактора Х происходит после расщепления связи Арг 194 -Иле 195 в Nконцевой части тяжелой цепи с освобождением пептида активации. Тромбин Протромбин Образование тромбина в результате последовательного расщепления 2 -х связей в молекуле протромбина (молекула – α тромбина из 2 -х цепочек, соединенных дисульфидным мостиком, активный центр и S-связывающий Фибриноген участок в В цепи, при аутолизе: β и γтромбины со значительно меньшей свёртывающей активностью). Тромбин диссоциирует из протромбиназного комплекса и может участвовать в Совместно с тромбоцитами регуляции многих физиологических и эритроцитами образуется процессов. Функции: прокоагулянтная тромб (активирует своё образование), антикоагулянтная, вазоактивная и

Каскадный механизм активации ферментов Последовательно образуются связанные с фосфолипидами клеточной мембраны комплексы, содержащие протеолитический фермент, белок-активатор и ионы Са 2+ : n VIIа-ТФ- Са 2+ n Теназа: IХа-VIIIа-- Са 2+ n Протромбиназа: Ха-Vа- Са 2+ Модель сборки комплекса факторов свертывания крови

Соотношение между концентрацией факторов и скоростью процесса свертывания. В норме скорость коагуляции практически не определяется концентрацией факторов, так как они присутствуют в избытке и процесс идет в состоянии насыщения. Только после значительного истощения фактора его концентрация будет влиять на скорость реакции и соответственно на скорость свертывания плазмы

Тромбоциты n n n Около 1/3 всей массы тромбоцитов находится в селезенке (селезеночный пул) Остальные 2/3 тромбоцитов циркулируют в крови. Средняя продолжительность жизни тромбоцитов составляет 9 -10 суток У здорового человека количество тромбоцитов может несколько меняться в течение суток. Нормальное содержание тромбоцитов в крови колеблется в пределах 150 -320 х109/л.

Жизненный цикл тромбоцита

Структура тромбоцита Интактные тромбоциты имеют форму диска, В цитоплазме расположены митохондрии, пероксисомы (содержат каталазу), включения гликогена, лизосомы и гранулы, содержащие пулы хранения различных веществ

Поверхностные гликопротеиновые (GP) рецепторы тромбоцита

Секретируемые факторы тромбоцитов

Тромбоспондин - гликопротеин, принимающий участие в адгезии и агрегации тромбоцитов Функции тромбоспондина • стабилизация комплекса фибриноген GPIIb IIIa в процессе агрегации тромбоцитов связывается с рядом коагуляционных факторов (тромбином, факторами IХа, Ха), что приводит к повышению их локальной концентрации и защищает от

Механизмы активации ферментов каскада Частичный протеолиз Взаимодействие с белками-активаторами Взаимодействие с модифицированными клеточными мембранами при участии ионов кальция Активация тромбоцитов сопровождается появлением на поверхности плазматической мембраны отрицательно заряженных участков, образованных фосфатидилсерином n Дополнительный механизм усиления процесса свёртывания крови за счёт положительной обратной связи. Тромбин может ускорять своё образование, активируя тромбоциты, факторы V и VIII, а также возможно VII и ХI. n Основные положительные обратные реакции факторов Ха и IХа –активация фактора VII. Всё это приводит к образованию тромба за 10 -15 секунд в месте повреждения сосуда. n n n

Белки-регуляторы активности протеаз системы свёртывания крови n IХа и их субстратов – факторов Х и протромбина с фосфолипидами (содержат по 3 домена, гомогичных церулоплазмину, по 2 Сдомена и центральный В-домен, который отщепляется при их активации). n В активированной форме фактор V гетеродимер, а фактор VIII- гетеротример, субъединицы которых взаимодействуют при участии ионов Са 2+ n В плазме фактор VIII циркулирует в виде комплекса с фактором фон Виллебранда, функции которого: адгезивный белок, обеспечивает связывание тромбоцитов с субэндотелиальными структурами и склеивание тромбоцитов при их агрегации; повышает стабильность фактора VIII и защищает его от инактивации протеином С.

Фактор Виллебранда (v. WF) выполняет роль «биологического клея» , прикрепляя к коллагену субэндотелия адгезированные тромбоциты через гликопротеиновый комплекс GPIb-V-IX. n Тромб увеличивается в размерах по мере адгезии и агрегации новых тромбоцитов, скрепление которых в агрегат обеспечивает фибриноген, имеющий дивалентную структуру и взаимодействующий с рецепторами GPIIb-llla n

Комплекс фактор VIII - фактор Виллебранда (ф. Vlll—v. WF) n n n состоит из 2 отдельных белков, которые выполняют в гемостазе разные функции, имеют разную химическую и иммунологическую структуру. Фактор VIII необходим для активации фактора X в каскаде свертывания крови, его дефицит вызывает гемофилию А. Фактор Виллебранда (v. WF) полимерный белок, который составляет основную массу комплекса. Он необходим для адгезии тромбоцитов к поврежденной стенке сосудов, обеспечивая взаимодействие коллагена с гликопротеиновым комплексом тромбоцитов GPIb-V-IX. Кроме того, он участвует в агрегации тромбоцитов, взаимодействуя с интегринами GPIIb-IIIa. Недостаток v. WF приводит к болезни Виллебранда

Vitamin K-зависимая модификация Ряд факторов свёртывания крови (II, VIII, IХ и Х) содержат необычную АК –γкарбоксиглутаминовую: она образуется в этих факторах посттрансляционно в результате реакции карбоксилирования, зависящей от витамина К. . Остатки γ-карбоксиглутаминовой кислоты образуют специфические центры связывания ионов Са 2+. Эти функциональные группы в процессе тромбообразования обеспечивают присоединение факторов свёртывания крови к фосфолипидам клеточных мембран тромбоцитов, поврежденных тканей и межклеточного . матрикса

Vitamin K-зависимая модификация n Антагонисты витамина К (пероральные антикоагулянты) ингибируют восстановление эпоксидной и хиноновой форм витамина К, образующихся в ходе реакции карбоксилирования остатков глутаминовой кислоты.

Этапы образования фибринового тромба

Фибриноген 3 пары неидентичных цепей Аα цепи, Вβ, и γ , связывает три иона Са 2+с высоким (находятся в С-концевой области γ цепи) и около 10 с низким сродством, содержит 4 раздваивающиеся углеводные цепи, образующие Nгликозидные связи с Асн 52 и Асн 364 β и γ-цепей, на концах – сиаловые к-ты n Фибриноген подвергается множественной посттранляционной модификации (гликозилирование, фосфорилирование, сульфатирование, гидроксилирование). n

ФИБРИНОГЕН Фибринопептиды А и В (ФПА и ФПВ) отщепляются тромбином от фибриногена, инициируя тем самым процесс полимеризации и превращение фибриногена в фибрин. Полимеризация фибриногена 1) Превращение фибриногена в мономер фибрина начинается после того, как в результате отщепления тромбином Nконцевого 16 -членого фибринопептида А в α цепи открывается участок Глу-Про-Арг, взаимодействующий с комплементарным участком в Сконцевой области γ цепи.

Коагуляционная фаза n Этапы образования фибринового тромба 2) Образование нерастворимого геля фибрина. Идёт инициация процесса самосборки протофибрилл, в которых периферический Д-домен одной молекулы взаимодействует с центральным Е-доменом другой (центры агрегации). Между доменами молекул фибринамономера образуются нековалентные связи. Молекулы фибрина смещены относительно друга на ½ длины Отщепление с N-конца Вβ цепи фибринопептида В (латеральная ассоциация протофибрилл)

3) Стабилизация геля фибрина: попарно сшиваются γ- цепи, а затем α- цепи фибриногена с образованием длинных полимеров. Фаза стабилизации геля фибрина протекает с участием активного фактора ХIII, который, являясь ферментом трансглутаминазой, катализирует реакцию образования по крайней мере 6 амидных связей между остатками Глу и Лиз, каждой из пептидных цепей фибрина, связывая их друг с другом и связывает фибрин с фибронектином - тромб фиксируется на месте.

4) Ретракция (сжатие) фибринового сгустка обеспечивает актомиозин тромбоцитов – сократительный белок тромбостенин, обладающий АТФ-азной активностью, участвует также в активации и агрегации тромбоцитов. n Ретракция кровяного сгустка предупреждает полную закупорку сосудов, создавая возможность восстановления кровотока. n Кровь здорового человека in vitro свёртывается за 5 -10 минут. При этом образование протромбиназного комплекса занимает 2 -5 сек и превращение фибриногена в фибрин 2 -5 сек. n

Антикоагулянтная фаза препятствует распространению тромба: короткий каскад реакций, в котором кроме тромбина участвуют белокактиватор тромбомодулин (Тм), витамин К-зависимая сериновая протеаза протеин С, белок-активатор S и факторы Va, VIIIa ; последовательно образуются 2 мембранных комплекса: IIa-Тм-Са 2+ и→ тромбин в его составе активирует протеин С, который в составе комплекса Са- S- Са 2+ гидролизует по 2 пептидные связи в факторах Va и VIIIa и превращает их в неактивные пептиды. n Тромбин - последний фермент каскада реакций коагуляции и он же тормозит его, вызывая образование комплексов антикоагулянтной фазы на неповреждённом эндотелии сосудов, т. к. приобретает способность активировать протеин С только после взаимодействия с тромбомодулином (причём связанный с Тм тромбин не может превращать фибриноген в фибрин, не активирует фактор V и тромбоциты). n

Прокоагулянтный и антикоагулянтный эффекты тромбина Тромбин оказывает прямой активирующий эффект на факторы V и VIII и инактивирующее действие на факторы Va и VIIIa. Фактор VIII может быть активирован высокими концентрациями фактора IXa или следовыми концентрациями тромбина. В то же время тромбин в комплексе с тромбомодулином стимулирует антикоагулянтный эффект протеина С. Эти формы регуляции существенны для эффективного участия факторов Va и VIIa в процессах свертывания крови

Система свертывания крови и система фибринолиза каскадные протеолитические ферментативные системы

Система фибринолиза состоит из профермента (плазминоген), ферментов, превращающих плазминоген (Пг) в сериновую протеазу, и сложный системы ингибиторов, контролирующих как активацию Пг, так и сам процесс лизиса фибрина. n После выполнения гемостатической функции и регенерации ткани фибрин должен быть удалён для восстановления нормального кровотока n Фибринолиз- ферментативное расщепление волокон фибрина с образованием растворимых пептидов, которые удаляются из сосудистого русла. n

Система противосвёртывания Ингибиторы сериновых протеаз: серпины выполняют свою функцию один раз в жизни. n Механизм действия: образуют стехиометрический комплекс с протеазой, в котором после расщепления по реактивному центру ингибитор остаётся ковалентно связанным с серином активного центра фермента. Этот комплекс выводится из кровотока и разрушается n

Антитромбин III (80 -90% антикоагуляционной активности) может образовывать неактивные комплексы почти со всеми факторами свёртывания крови, а не только с тромбином, а гетерополисахарид гепарин по действию сходен с катализатором. Одна его молекула может обеспечить присоединение большого количества антитромбина к соответствующим факторам свёртывания крови.

Основная функция протеина С (АПС) в гемостазе инактивация факторов Va и VIIIa блокада PAI

Дефицит n. S, так же как и дефицит ПС, при водит к развитию тромбозов Активированный протеин С (АПС), сопрягаясь с теназным комплексом на фосфолипидной поверхности (активированный тромбоцит), вызывает деградацию фактора V. ТМ тромбомодулин, С 4 СП связывающий протеин, F 1 S протеин S, ПС протеин С, На, Va активированные плазменные факторы, Vi деградированный

Урокиназа (синтезированная в почках) в области повреждения выделяется из клеток и попадает в тромб, может активировать как свободный, так и связанный с фибрином плазминоген Пг. n Компоненты системы фибринолиза участвуют также в разрушении внеклеточного матрикса и могут выполнять важную функцию в регуляции таких процессов, как эмбриогенез, регенерация тканей, рост и метастазирование опухолей. n Урокиназу, тканевой активатор плазминогена и стрептокиназу используют при тромболитической терапии инфаркта миокарда, тромбозах вен и артерий, гемодиализе. n

Фибринолитический процесс Стрептокиназа

Особенности гемостаза у новорожденных n В раннем постнатальном периоде – физиологическое снижение уровня факторов свёртывания (II, YII, IX, X, XII), антикоагулянтов (антитромбина III, протеина С и др. ), основных компонентов фибринолиза и калликреин-кининовой системы. Система гемостаза уравновешена, но на более низком уровне, чем у детей более старшего возраста и взрослых. Снижение активности системы гемостаза – защитный механизм, т. к. у ребёнка неизбежна активация системы при рождении и в ранний постродовой период.

Особенности гемостаза у новорожденных На состояние системы гемостаза новорожденных влияют сроки перевязки пуповины и первого прикладывания к груди. Ранняя перевязка пуповины до перекачивания крови из плацентарных сосудов в кровоток ребёнка приводит к большему снижению Квитаминзависимых факторов свёртывания к 3 -4 дням жизни. n Недоношенность приводит к более выраженному снижению уровней как прокоагулянтов, так и антикоагулянтов, вследствие чего у этих детей существенно возрастает риск как геморрагических, так и тромботических осложнений, но особенно ДВС-синдрома. n

Гемофилия наследственные болезни (1: 10 000) характеризуются повышенной кровоточивостью n обусловлены недостаточностью белков свёртывающей системы крови n Гемофилия А- мутация гена фактора VIII в Ххромосоме- 80% всех случаев болезни n Гемофилия В- мутация гена фактора IХ n

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ