Биохимия и молекулярная биология Лекция 6 Репликация ДНК

Биохимия и молекулярная биология Лекция 6. Репликация ДНК 1

Тема лекции n n Основные принципы репликации ДНК Репликация ДНК E. coli Репликация ДНК у эукариот Репарация ДНК Репликация ДНК 2

Основные принципы репликации ДНК Пути передачи генетической информации в клетке Репликация ДНК 3

Основные принципы репликации ДНК Синтез (репликация, удвоение) ДНК Репликация (синтез) ДНК происходит не беспорядочно, а в строго определенный период жизни клетки. Синтез ДНК происходит в S-фазу клеточного цикла, когда клетка готовится к делению. Репликация ДНК 4

Основные принципы репликации ДНК Три механизма репликации ДНК а) полуконсервативный; б) консервативный; в) дисперсивный Репликация ДНК 5

Основные принципы репликации ДНК Эксперимент Мезелсона-Сталя подтвердил полуконсервативный механизм репликации ДНК Репликация ДНК 6

Основные принципы репликации ДНК n n n 1958 г Мэтью Мезельсон, Франклин Сталь Доказательство полуконсервативного механизма репликации ДНК Артур Корнберг – Открытие ДНКполимеразы Репликация ДНК 7

Основные принципы репликации ДНК Основные принципы репликация ДНК 1. Комплементарность. 2. Полуконсервативность. 3. Антипараллельность. 4. Прерывистость. 5. Потребность в затравке. Репликация ДНК 8

Репликации ДНК Комплементарность, полуконсервативность и антипараллельность процесса репликации Репликация ДНК 9

Основные принципы репликации ДНК Репликация ДНК осуществляется реплисомой РЕПЛИСОМА – сложный и эффективно работающий мультиферментнй комплекс, формирующийся в репликативной вилке для осуществления синтеза ДНК. Cодержит примерно 15 - 20 белков и включает: • Топоизомеразу • Хеликазу • ssb-белки (single strand binding proteins) • Праймазу • множество дополнительных белков • ДНК – полимеразы Репликация ДНК 10

Компоненты реплисомы Белки, необходимые для репликации ДНК • Dna A - узнавание области начала репликации, привлечение к месту сборки остальныхт белковых компонентов; • Dna B - ДНК-хеликаза – разделение цепей ДНК в репликативной вилке; • Dna C - обеспечение взаимодействия хеликазы и праймазы с ДНК; • Dna G - праймаза – синтез РНК-затравок; • ssb - белки, взаимодействие кооперативно с одноцепочечной ДНК и стабилизирующие расплетенный комплекса; • ДНК-лигаза – лигирование (сшивание) фрагментов Оказаки; • Топоизомераза I – создание шарнина для раскручивания цепей ДНК в репликативной вилке; • Топоизомераза II – (ДНК-гираза) - разделение катенанов. Репликация ДНК 11

Компоненты реплисомы ДНК –полимеразы прокариот ■ У прокариот есть пять ДНК-полимераз - Pol I, Pol III, Pol IV и Pol V. ■ В репликации ДНК принимают участие Pol I и Pol III. ■ ДНК-П I участвует в удалении праймера, застройке образовавшейся бреши, коррекции ошибок. ■ ДНК –П III - основной фермент репликации ДНК, синтезирует лидирующую и отстающую цепь ДНК, обладает корректорской функцией. ■ ДНК-П II, IV и V осуществляют репаративный синтез ДНК. Репликация ДНК 12

Компоненты реплисомы Свойства ДНК-полимераз Е. Соli Свойства ферментов Pol III Молекулярная масса (к. Да) Число оборотов (мин-1) 103 90 830 600 30 1200 1 ≥ 4 ≥ 10 pol. A pol B pol C Полимеразная реакция да да да Экзонуклеазная реакция 5'→ 3' Экзонуклеазная реакция 3'→ 5' да нет да да да Число субъединиц Структурный ген 5'→ 3' Репликация ДНК 13

Компоненты реплисомы ДНК –полимераза III E. coli Кор-фермент (αθε) β-белок выполняет функцию «скользящего зажима» τ - белок - сборка и димеризация холофермента ДНК-полимеразы γ-комплекс (γ, δ, δ´, χ, ψ) – cвязывание с матрицей, активация ДНК-полимеразы Репликация ДНК 14

ДНК- полимераза III Реакция, катализируемая ДНК-полимеразой ДНК П III осуществляет элонгацию молекулы ДНК, добавляя нуклеотиды к 3΄-концу предшествующего нуклеотида. От дезоксинуклеозидтрифосфата отделяется РРi, который далее расщепляется до двух молекул фосфорной кислоты. Репликация ДНК 15

ДНК- полимераза III Реакция, катализируемая ДНК-полимеразой Репликация ДНК 16

ДНК- полимераза III Для работы ДНК-полимеразы необходимы: ДНК-матрица; субстраты - ТТР, d. АТP, d. GТP, d. CТP; ионы Mg 2+; источники энергии - ТТР, d. АТP, d. GТP, d. CТP; затравка (праймер) со свободной 3ʹ-ОНгруппой. Репликация ДНК 17

ДНК- полимераза III Корректорская функция ДНКполимеразы Репликация ДНК 18

Репликации ДНК Прерывистый механизм репликации Биосинтез ДНК – матричный процесс. Каждая цепь ДНК служит матрицей для синтеза комплементарной дочерней цепи. Синтез ведущей (лидирующей) дочерней цепи ДНК идет непрерывно в направлении 5´→ 3´, совпадающим с движением репликативной вилки. Отстающая дочерняя цепь ДНК – синтез прерывистый, в виде фрагментов Оказаки. Репликация ДНК 19

Репликации ДНК Три этапа репликации ДНК Инициация – образование репликативной вилки Элонгация – синтез новых цепей Терминация – завершение синтеза двух дочерних цепей ДНК Репликация ДНК 20

Этапы репликации I. Инициация репликации. У бактерий инициация репликации ДНК начинается в уникальном сайте хромосомы, точке репликации – ori C, из которой репликация осуществляется двунаправлено до точки окончания (terminus). Оri C – инициирующая последовательность Е. coli длиной 245 пар характеризуется высоким содержанием АТ-пар, которые легко денатурируют. К этому участку присоединяются 10 -20 молекул инициаторного белка dna. A и АТР. Это приводит к плавлению молекулы ДНК и раскрытию цепей. Далее происходит присоединение белков dna. С, dna. В (хеликазы), ssb-белков и dna. G (праймазы). Формируется репликативная вилка. Репликация ДНК 21

Этапы репликации Ориджин репликации Репликация ДНК 22

Компоненты реплисомы Образование репликативной вилки Репликация ДНК 23

Этапы репликации II. Элонгация. Синтез цепей ДНК происходит в направлении 5′ → 3 ′ растущей цепи. Очередной нуклеотид присоединяется к свободному 3 ′-ОН-концу предшествующего нуклеотидного остатка. Синтезируемая цепь всегда антипараллельна матричной цепи. Репликация ДНК 24

Этапы репликации II. Элонгация. В процессе элонгации происходит наращивание дочерних полинуклеотидных цепей ДНК. Каждая репликативная вилка включает, по крайней мере, две молекулы ДНК-полимеразы III (димер) , ассоциированные с несколькими вспомогательными белками. К последним относятся ДНК-топоизомераза, которая раскручивает плотно свернутую двойную спираль ДНК, и хеликаза, которая расплетают двухтяжевую ДНК на две цепи. Ведущая цепь ДНК реплицируется непрерывно в направлении 5ʹ→ 3ʹ, совпадающим с движением репликативной вилки. Отстающая цепь считывается в направлении, противоположном движению репликативной вилки. Преодоление антипараллельности цепей ДНК при репликации достигается путем образования петельной структуры. Отстающая цепь ДНК временно образует петли вокруг реплисомы так, что димер ДНК -полимеразы получает возможность перемещаться одновременно по обеим цепям в одном 5ʹ→ 3ʹ направлении на короткое расстояние. Репликация ДНК 25

Репликация ДНК E. coli Репликация ДНК 26

Этапы репликации II. Элонгация. Мономер ДНК-полимеразы, копирующий эту цепь , через небольшой промежуток времени, синтезировав короткий отрезок ДНК, покидает матричную отстающую цепь. Эти короткие (до 1000 пар нуклеотидов) отрезки ДНК, образующиеся на отстающей цепи, получили название фрагментов Оказаки – по имени Р. Оказаки, впервые (1968 год) указавшего на прерывистый характер синтеза ДНК. Новое присоединение мономера ДНК-полимеразы к матрице происходит после предварительного синтеза нового праймера. Каждый фрагмент Оказаки начинается с короткой РНК-затравки (10 – 12 пар нуклеотидов), необходимой для функционирования ДНК-полимеразы. ДНК-полимераза III достраивает этот праймер до фрагмента ДНК длиной 1000 -2000 дезоксинуклеотидных звеньев. Кроме полимеризации цепей, которую осуществляет Рol III, в ходе элонгации ДНК происходят следующие события: 1) вырезание РНК-праймеров из фрагментов Оказаки. Эту функцию выполняет Pol I, благодаря 5´→ 3´-экзонуклеазной активности; Репликация ДНК 27

Этапы репликации II. Элонгация репликации. 2) заполнение брешей, оставшихся после удаления праймеров. В этом процессе участвует также ДНКполимераза I, используя для встраивания нуклеотидов 3´ОН-группу соседнего фрагмента Оказаки; 3) Соединение фрагментов Оказаки в отстающей цепи с помощью фермента ДНК-лигазы; 4) Исправление ошибок репликации, благодаря 3´→ 5´экзонуклеазной активности, которой обладают как Pol III, так и Pol I. III. Терминация репликации. Терминация синтеза ДНК наступает вследствие исчерпания матрицы. Репликационные «глазки» сливаются, и на каждой матричной цепи образуется дочерняя цепь ДНК. Репликация ДНК 28

Репликация ДНК E. coli Репликация ДНК 29

Репликация ДНК E. coli Репликация ДНК 30

Репликация ДНК E. coli ДНК - лигаза Репликация ДНК 31

Репликация ДНК E. coli Функции ДНК-полимеразы I Репликация ДНК 32

Репликация ДНК E. coli Репликация ДНК 33

Репликация ДНК E. coli Инициация репликации Раскручивание двойной спирали Топоизомераза, хеликаза, ssb-белки ДНК, плавление Н-связей между комплементарными нуклеотидами, формирование репликационной вилки Синтез ведущей цепи Синтез Праймаза праймера Синтез отстающей цепи Синтез праймера для Праймаза фрагмента Оказаки Элонгация ДНК-полимераза III Элонгация фрагмента ДНК-полимераза Оказаки III Замена РНКпраймера фрагментом ДНК-полимераза I Замена РНК-праймера ДНК-полимераза фрагментом ДНК I Соединение фрагментов Оказаки Репликация ДНК-лигаза 34

Репликация ДНК E. coli Репликация ДНК 35

Репликация у эукариот Репликация ДНК у эукариот ДНК хромосом эукариот много длиннее, а сами хромосомы устроены намного сложнее, чем маленькие и простые бактериальные геномы. У высших клеток, в отличие от бактерий, ДНК в хромосомах образует комплекс с белками (гистонами), которые участвуют в сворачивании длинных нитей ДНК в серию петель, для того чтобы их можно было упаковать внутри ядра. Репликация ДНК 36

Репликация у эукариот Репликация ДНК начинается одновременно в нескольких сайтах гигантской молекулы ДНК каждой хромосомы. Число их у эукариот может превысить 1000, поэтому большой набор ДНКпоследовательностей реплицируется за 5— 20 часов. Из каждой такой точки в противоположных направлениях одновременно движутся две репликативные вилки. Репликация продолжается до полного завершения синтеза дочерних цепей и разделения новых дуплексов. Репликация ДНК 37

Репликация у эукариот Репликация ДНК 38

Компоненты реплисомы Свойства ДНК-полимераз эукариот Свойства ферментов α δ ε β γ Масса (k. Da) > 250 170 256 36 -38 160 -300 Локализация ядро митохондр ии нет да да нет нет да нет высокая низкая высокая Репликация да да да нет да Репарация нет ? да да нет Сопутствующие активности: 3' → 5' экзонуклеазная праймазная Точность Репликация ДНК 39

Репликация у эукариот Эукариотические ДНК-полимеразы Полимераза α синтезирует праймер, (20 нуклеотидов), а затем заменяется полимеразой δ и ε. Полимераза δ является основной ДНК-полимеразой у эукариот. Роль ДНК-полимеразы ε менее ясна, однако последние данные свидетельствуют о том, что она участвует в репликации отстающей цепи ДНК-полимераза β удаляет праймеры и застраивает бреши, образовавшиеся на месте вырезанного праймера. Фрагменты Оказаки у эукариот имеют длину порядка 150 -200 нуклеотидов. Они сшиваются ДНК-лигазой. ДНК-полимераза γ реплицирует митохондриальную ДНК. Репликация ДНК 40

Репликация у про- и эукариот Разница в репликации ДНК у про- и эукариот Прокариоты Эукариоты Пять полимераз (I, III, IV, V) Пять полимераз (α, β, γ, δ, ε) Функции полимераз: I участвует в репликации, коррекции, репарации и удалении РНК-праймеров II –фермент репарации III – главный фермент репликации IV – участвуют в репарации Полимеразы являются также экзонуклеазами Функции полимераз: α – синтез праймера β – синтез праймера, застраивание бреши γ – репликация митохондриальной ДНК δ – основной фермент репликации ε – фермент, реплицирующий отстающую цепь ДНК Не все полимеразы обладают экзонуклеазной активностью Один ориджин репликации Несколько ориджинов репликации Фрагменты Оказаки длиной 10002000 нуклеотидов Фрагменты Оказаки длиной 150 -200 нуклеотидов ДНК не связана с белками Репликация ДНК в комплексе с гистонами 41

Репликация ДНК у эукариот Репликации ДНК у эукариот Репликация ДНК 42

Репарация ДНК Репарация генетических повреждений – свойство живых организмов восстанавливать нарушения и повреждения, возникшие в ДНК в результате ошибок репликации, а также при воздействии разнообразных эндогенных и внешних мутагенных факторов. Осуществляется специальными ферментными системами клетки. Повреждающие факторы: Радиация Ультрафиолетовое излучение Химические вещества Ошибки репликации Апуринизация – отщепление азотистых оснований от сахарофосфатного остова Дезаминирование – отщепление NH 2 -группы от азотистого основания Репликация ДНК 43

Репарация ДНК Типы повреждений молекулы ДНК Репликация ДНК 44

Репарация ДНК Типы повреждений ДНК Репликация ДНК 45

Репарация ДНК Образование пиримидинового димера Репликация ДНК 46

Репарация ДНК Типы повреждений молекулы ДНК АП-сайты В каждой клетке млекопитающих за одну 20 -ти часовую генерацию спонтанно возникает около 10000 апуриновых сайтов и около 500 – апиримидиновых. Репликация ДНК 47

Репарация ДНК путем прямого восстановления повреждений Репликация ДНК 48

Ориджин репликации Репликация ДНК 49