Биотехнология вторичного метаболизма История вопроса. o Первые данные по синтезу вторичных соединений в клеточных культурах растений появились в литературе в 1940 г. (Дж. Бонер). Образование каучука клетками гваюлы. o Первыми лекарственными растениями, исследованными в культуре ткани, были барвинок розовый и белена черная (В. Телле и Ф. Готре). Показана способность культуры ткани белены к синтезу алкалоидов.
Биотехнология вторичного метаболизма Преимущества биотехнологических методов перед традиционными: o Процесс получения биомассы клеток автоматизирован и не зависит от сезона, климатических и почвенных условий. o Возможность оптимизации условий культивирования суспензии клеток, что позволяет целенаправленно синтезировать нужные вещества.
Биотехнология вторичного метаболизма растений Использование клеточных культур важно когда: o невозможно выращивать растения в природе o имеются трудности при сборе o содержание вторичных соединений в культурах in vitro высокое o возможен хороший рост клеточных культур на сравнительно простых по составу питательных средах o вторичные метаболиты выделяются клетками в питательную среду o можно получить высокопродуктивные растительные культуры.
Клеточная и тканевая инженерия растений o Клеточная инженерия (метод культуры изолированных тканей) позволяет выделять и культивировать в стерильных условиях in vitro ткани и клетки высших многоклеточных организмов. o В основе клеточной инженерии возможность использования принципиально нового объекта – изолированной культуры клеток и способности каждой растительной клетки давать начало целому организму.
Основные направления клеточной инженерии растений o Использование изолированных клеток в селекции на устойчивость к различным неблагоприятным факторам среды (засухе, засолению, низким и высоким температурам, фитопатогенам и т. п. ). o Использование культуры изолированных тканей для размножения и оздоровления посадочного материала. o Получение ценных для медицины, парфюмерии и косметики веществ вторичного синтеза.
Трансгенные растения o Трансгенными называются те виды растений, в которых успешно функционирует ген (или гены) пересаженные из других видов растений или животных. o Существуют проблемы, которые не могут быть решены такими традиционными направлениями как селекция, кроме того, что на подобные разработки требуются годы, а иногда и десятилетия. Создание трансгенных растений, обладающих нужными свойствами, требует гораздо меньшего времени и позволяет получать растения с заданными хозяйственно ценными признаками, а также обладающих свойствами, не имеющими аналогов в природе.
Создание трансгенных растений в настоящее время развиваются по следующим направлениям: 1. o o «молекулярная селекция» (molecular breeding) Получение сортов с/х культур с более высокой урожайностью Получение с/х культур, дающих несколько урожаев в год Создание сортов с/х культур, токсичных для некоторых видов вредителей Создание сортов с/х культур, устойчивых к неблагоприятным климатическим условиям (например, были получены устойчивые к засухе трансгенные растения, имеющие в своем геноме ген скорпиона) 2. «молекулярное производство» (molecular farming) o Получение и использование трансгенных растений в качестве биореакторов, продуцирующих ценные для промышленности и медицины органические соединения.
Трансгенные растения и перспективы их использования в качестве источника фармацевтических препаратов. Метаболическая инженерия растений Метаболическая инженерия направлена на проведение трансгенной клеткой новых биохимических реакций. o Эти реакции детерминируют ферменты, кодируемые чужеродными генами или собственными модифицированными генами. o Растения представляют один из наиболее привлекательных объектов для метаболической инженерии.
Трансгенные растения и перспективы их использования в качестве источника фармацевтических препаратов. o Примером метаболической инженерии является получение новых растений – продуцентов скополамина. o Скополамин, как и атропин, является антихолинэргическим лекарственным веществом. o Перенос гена гиосциамин-6 b-гидроксилазы из белены (Hyoscyamus niger) в растения красавки (Atropa belladonna) превратил продуцент атропина в продуцент скополамина. атропин скополамин
Трансгенные растения и перспективы их использования в качестве источника фармацевтических препаратов. Создание растений с улучшенными лечебно-диетическими свойствами o Ген фитоен-синтетазы из нарцисса введен в рис и экспрессирован в эндосперме риса. Таким образом, получен «золотой рис» , который может помочь 2 млрд. человек, страдающих от дефицита витамина А, для которых рис – основная пища. o Получены трансгенные растения рапса, в семенах которых значительно повысилось содержание каротиноидов. Показана экспрессия этого же фермента в клубнях картофеля, что приводило к повышенному синтезу каротиноидов и лютеина. o Недавно получены трансгенные растения земляники с повышенным синтезом L-аскорбиновой кислоты
Трансгенные растения и перспективы их использования в качестве источника фармацевтических препаратов. Конструирование трансгенных растений – продуцентов целевых белков и антител. o Первым фармацевтически значимым белком, экспрессированным в растениях табака и подсолнечника в 1986 г. , явился человеческий гормон роста - СОМАТОТРОПИН. С тех пор множество других ценных белков были синтезированы в самых различных растениях.
Белки, синтезируемые трансгенными растениями Белок Область применения Растение Соматотропин Гормон роста Табак, подсолнечник Человеческий сывороточный альбумин Цирроз печени, ожоги, хирургия Табак, картофель Эпидермальный фактор роста Стимуляция роста клеток кожи и роговицы Табак α-Интерферон Гепатиты В и С Рис, турнепс, картофель, табак Эритропоэтин Анемия Табак α, β-Гемоглобин Заменитель крови Табак β-Казеин Пищевая добавка Картофель Коллаген Заживление ран Табак Лактоферрин Бактериальные инфекции Картофель Трипсин Расщепление белков Кукуруза
Антитела синтезируемые в трансгенных растениях. Применение Растение табак Раково-эмбриональный антиген человека Тип антител Мышино-человеческие химерные антитела Ig. G 1 (c. T 84. 66), sc. Fv T 84. 66, T 84. 66/G 68 Онкология (рак кишечника, легких, опухоли эпителиального происхождения Антиген пшеница sc. Fv. T 84. 66 рис табак люцерна Нейтрализация вируса бешенства Белок вируса бешенства Моноклональные антитела m. Ab SO 57 ИФА-диагностика Антитела против человеческого Ig. G C 5 -1 Ig. G Guy’s 13 Ig. G Предотвращение зубного кариеса Поверхностный антиген стрептококка SAI/II Терапия рака толстой кишки Лечение герпеса типа 2 Ig. A/G s. Ig. A/G табак Поверхностный антиген CO-17 A Ig. G Nicotiana benthamiana Белок вируса герпеса HSV-2 или s. Ig. A Ig. G 1 Fab и F(ab′)2 рис, соя
Синтез вакцин в трансгенных растениях o К настоящему времени имеются публикации по синтезу более 50 различных человеческих и животных антигенов в трансгенных растениях. o Например, поверхностный антиген оболочки вируса гепатита В синтезируется трансгенными растениями табака, картофеля, люпина, салата и бананов. o В настоящее время интенсивно разрабатывается концепция «съедобных вакцин» на основе трансгенных растений, чьи плоды, листья и семена годятся в пищу.
Промышленный синтез вторичных метаболитов o Суспензионная культура клеток (регулируемые условия). o Культуры клеток растений могут синтезировать практически все классы вторичных метаболитов, причем довольно часто в количествах, в несколько раз превышающих их синтез в целых растениях.
Промышленный синтез вторичных метаболитов o Культуры ткани табака накапливают больше никотина (до 0, 7%). Содержание никотина в листьях табака 0, 3 – 0, 4 % (от сухого веса) o Диоскорея. Содержание диосгенина в дикорастущих растениях колеблется от 0, 9 до 2, 2%, а в культуре - 1, 06 -1, 17%;
Культуры растительных клеток и тканей как источник получения лекарственных средств o Диосгенин – из клеток диоскореи o Аймалин – из клеток раувольфии змеиной o Подсластитель стевиозид из культуры клеток стевии
Диосгенин o Стероидные сапонины встречаются редко, преимущественно в растениях сухого и жаркого климата. o Впервые диосгенин (около 1%) был выделен в 1936 году. o Наибольшее развитие получение сапогенинов из растений диоскореи нашло в Мексике. Наиболее значительные количества диосгенина были найдены в мексиканских тропических видах D. floribunda. (содержат в корневищах до 10% диосгенина), D. spiculiflora (до 15%), D. composita (до 13, 2%). o Эти виды являются основными источниками стероидных сапогенинов в Латинской Америке и
Препараты из диоскореи o o o Фармакологические свойства- тормозят развитие атеросклероза, артериальной гипертензии, стимулируют моторную и секреторную деятельность желудочнокишечного тракта, возбуждают сокращения изолированного отрезка кишки и тормозят всасывание холестерина из кишечника. Препараты диоскореи дают некоторый рентгенозащитный эффект, Лекарственные средства. Препарат "Полиспонин" (таблетки по 0, 1 г). Применение. Препараты диоскореи применяют в комплексной терапии при общем, церебральном и коронарном атеросклерозе в качестве гипохолестеринемического средства, как в начальных стадиях атеросклероза (для профилактики), так и при выраженных формах заболевания.
Аймалин o Аймалин - алкалоид индольного типа раувольфии змеиной o Аймалин – эффективное антиаритмическое средство IA класса o Аймалин —обладает нормализующим влиянием на нарушенный ритм сердечной деятельности. o Аймалин снижает артериальное давление, замедляет частоту сердечных сокращений, обладает антихолинэстеразным действием. o Выход аймалина в культуре клеток составляет 1, 3% сухой массы, а в целом растении – 0, 26%
Стевиозид – заменитель сахара o Родиной стевии ( Stévia) — многолетнего растения семейства Астровые является южная и Центральная америка. Стевиозид зарегистрирован в в качестве пищевой добавки E 960 как подсластитель. o Медицинские исследования показали хорошие результаты использования экстракта стевии для лечения ожирения и гипертонии.
Перерыв
Тонизирующие вещества из клеток женьшеня Женьшень Панаксозид
Стимулирующие препараты из женьшеня o Настойку женьшеня применяют при переутомлении и неврастении. o Промышленный способ получения стероидных гликозидов женьшеня высоко продуктивен. o Прирост корня женьшеня в тайге составляет 1 г в год, на плантации – 3 г в год, а при выращивании in vitro можно получать 0, 4 г сухой массы на литр среды в день. o Биомасса клеток женьшеня в суспензии при выращивании в 50 -литровом ферментере увеличивается до 2 г в литре среды за сутки, что в тысячу раз больше, чем при выращивании на плантации.
Стимулирующие препараты из женьшеня o Учитывая высокую стоимость женьшеня (1 кг плантационного корня стоит 100150 USD), а цена дикорастущего корня может доходить до нескольких тысяч долларов. o Поэтому с экономической точки зрения биотехнологический способ получения биомассы культуры клеток женьшеня весьма перспективен.
Промышленный синтез вторичных метаболитов o Препарат таксол (паклитаксел) содержится в коре очень редкого и медленно растущего дерева – тиса. Чтобы выделить количество необходимое для лечения только одного пациента нужно собрать кору с 10 -12 взрослых деревьев. o Сейчас препарат выделяют из культуры клеток тиса (ОАО «Биохиммаш)
Таксол – противораковый препарат o Дитерпеноид таксол, выделен из коры тиссового дерева в 1971 г. o Таксол эффективен при раке молочной железы, легких, и пищевода.
Промышленный синтез вторичных метаболитов o Вещества вторичного синтеза, как правило получают из суспензионной культуры, которую выращивают в биореакторах или ферментерах. o Технология выращивания культур клеток в биореакторах - масштабный промышленный процесс. В Германии есть биореакторы объемом 75 куб. м. (фирма Futon). В России в Ярославле женьшень получают в биореактора объемом 7, 5 куб. м.
Промышленный синтез вторичных метаболитов o Продуктивность клеточных культур зависит от состава питательной среды. o В состав питательных сред для выращивания клеточных культур входят: 1. углеводы (лучше всего глюкоза и сахароза содержание около 5%) 2. минеральные соли (калий, азот (аммонийный и нитратный), фосфор) 3. Фитогормоны (ауксины, цитокинины)
Биорегуляция продуктивности вторичного метаболизма. Регуляция продуктивности склероциев спорыньи в биотехнологической системе гриб-растение. o После цветения злаков в пораженных зернах образуются склероции, которые выступают на колосе. В зависимости от вида зерновых размер склероции спорыньи изменяется от нескольких миллиметров до 4 см (у ржи). o Возбудителем инфекции является гриб Claviceps purpurea o В завязи образуется мицелий, который затем приобретает затем форму рожка и, в дальнейшем, сохраняет свою жизнеспособность в течение одного года.
Регуляция продуктивности склероциев спорыньи в биотехнологической системе гриб-растение. o o Спорынья, культивируемая на ржи, продуцирует эргоалкалоиды – производные лизергиновой кислоты. Известно 12 эрноалкалоидов. В медицине эргоалкалоиды применяются главным образом как средства, стимулирующие сокращение матки. Известно более 80 лекарственных средств на основе эргоалкалоидов спорыньи.
Регуляция продуктивности склероциев спорыньи в биотехнологической системе гриб-растение. В природе во время цветения ржи споры гриба попадают на цветок злака и прорастают. Мицелий гриба проникает в завязь и прорастает в ней, выделяя сахаристую жидкость (медвяная роса) привлекающую насекомых. Насекомые разносят споры гриба на другие цветки и заражают их (вторичное заражение растений). На колосе формируются сплетения грибницы – склероции – имеющие форму рожка. Это зимующая форма гриба. Затем склероции осыпаются, зимуют в почве и весной прорастают, образуя красно-фиолетовые плодовые тела в которых образуются новые споры. Эти споры разносятся ветром и цикл повторяется.
Регуляция продуктивности склероциев спорыньи в биотехнологической системе гриб-растение. o В биотехнолическом производстве гриб спорыньи культивируется в условиях питательной среды. o В качестве питательной среды используется пивное сусло с агар-агаром. o Процесс проводят в ферментерах объемом до 200 л. o Посевы ржи инфицируют искусственно выращенными спорами гриба. o Созревшую спорынью убирают машинами, сушат и получают 1500 кг/га o В естественных условиях удается получить около 100 кг/га
Биотехнология получения антибиотиков o Среди вторичных метаболитов ведущее место по объему производства занимают антибиотики. o В мире ежегодно производится антибиотиков на 20 млд. USD o Мощная индустрия производства антибиотиков созданная в СССР в 50–е годы производила до 3000 тонн в год
Биотехнология получения антибиотиков o Определение: антибиотик – низкомолекулярные вещества природного происхождения, способные подавлять рост живых клеток. o Антибиотики продуцируемые растениями – фитонциды. o Антибиотики возникли в борьбе за существование почвенных биоценозов (средства нападения и защиты o Способность нитчатого гриба зеленой плесени Penicillium notatum вызывать гибель микроорганизмов впервые была установлена в 1928 г. английским микробиологом А. Флемингом o В настоящее время известно более 12000 антибиотиков, из которых 200 медицинские препараты.
Промышленная биотехнология антибиотиков Промышленные мутантные штаммы - «суперпродуценты» Технологические требования: 1. Супервысокая продуктивность. 2. Антибиотик, образуемый в огромных количествах, не должен влиять на собственный биосинтез и жизнедеятельность своего продуцента. 3. Максимум концентрации антибиотика достигается когда рост культуры уже завершен. 4. Антибиотик синтезируется в местах клетки, изолированных от мест жизненно важных для жизнедеятельности этой клетки. 5. Транспорт антибиотика через оболочку клетки односторонний o
Классификация антибиотиков o Антибиотики алициклы (тетрациклины) o Антибиотики ароматического ряда (левомицетин) o Антибиотики гетероциклы (пеницилины) o Антибиотики гликозиды: 1. 2. 3. 4. стрептомицины аминогликозиды (гентамицин) макролиды (эритромицин) полиены (нистатин)
Наиболее распространенные антибиотики По типу действия антибиотики делят на бактерицидные (лактамы и аминогликозиды) – вызывают гибель микроорганизмов и бактериостатические (макролиды, тетрациклины, левомицетин) – нарушают способность микроорганизмов делиться.
Механизмы действия антибиотиков на бактерии различны: o Нарушение биосинтеза пептидов клеточной стенки (пенициллины, ванкомицин, цефалоспорин) o Нарушение отдельных этапов трансляции (тетрациклины, макролиды, амфениколы) o Повреждения цитоплазматической мембраны (грамицидин) o Нарушение биосинтеза нуклеиновых кислот (актиномицин, противоопухолевые антибиотики) o Нарушение энергетического обмена (олигомицин)
Привыкание к антибиотикам Резистентность o Первоисточник генов резистентности находится в почве у почвенных микроорганизмов – продуцентов антибиотиков. Они могут передаваться через промежуточных хозяев патогенным микроорганизмам.
Борьба с резистентностью микроорганизмов на примере пенициллинов o Ферменты β-лактамазы (пенициллазы) расщепляют βлактамное кольцо и инактивируют антибиотики лактамного (пенициллинового) типа. Ацилазы отщепляют ацильную группу o Для борьбы с такими β-лактамазами создают (синтезируют) молекулы не захватывающиеся этими ферментами.
Полусинтетические антибиотики o Полусинтетические антибиотики – введение новых химических радикалов (модификация) природных антибиотиков o Исходным продуктом в синтезе служит 6 аминопенициллановая кислота, получаемая биотехнологическим методом
Полусинтетические антибиотики o Ацилированием аминогруппы 6 аминопенициллановой кислоты (6 -АПК) получен ряд новых устойчивых полусинтетических антибиотиков.
Новые полусинтетические антибиотики
Теория взаимозаменяемости антибиотиков
Скачать презентацию Биотехнология вторичного метаболизма История вопроса o Первые данные
лекция 6 биотехнология вторичного метаболизма.ppt