Биотехнология растений Лекция 6 : :

Скачать презентацию Биотехнология растений  Лекция 6 : : Скачать презентацию Биотехнология растений Лекция 6 : :

biotehnologiya-7.ppt

  • Размер: 20.3 Мб
  • Автор:
  • Количество слайдов: 87

Описание презентации Биотехнология растений Лекция 6 : : по слайдам

Биотехнология растений Биотехнология растений

Лекция 6 : : Трансгенные растения- 44 1. Получение инсерционных мутантов растений на основеЛекция 6 : : Трансгенные растения- 44 1. Получение инсерционных мутантов растений на основе агробактериальной трансформации a) Клонирование генов b) Изучение с помощью трансгенных растений экспрессии генов и структуры растительных промоторов c) Получение растений со сверхэкспрессией гена с целью изучения функции гена d) Использование методов «генетической хирургии» для изучения взаимодействия клеток и тканей в процессах развития e) Использование трансформации для изучения роли гормонов в развитиии растений.

Т-ДНК инсерционный мутагенез интеграция Т-ДНК изменение структуры одного из генов  за счет встраиванияТ-ДНК инсерционный мутагенез интеграция Т-ДНК изменение структуры одного из генов за счет встраивания Т-ДНК… …. отбор по измененному фенотипу

Схемы используемых плазмид для получения : рецессивных мутаций доминантных мутаций 35 S-GUS RB LBСхемы используемых плазмид для получения : рецессивных мутаций доминантных мутаций 35 S-GUS RB LB Ti -плазмида T- ДНК 35 S-GUS RB LB Ti -плазмида. X T- ДНК X X — усилители транскрипции из промотора 35 SS Ca. MV

Клонирование генов Клонирование генов

Клонирование гена agamous с помощью Т-ДНК инсерционного мутагенеза wt ЭМС-мутаг енез 10 лепестков, Клонирование гена agamous с помощью Т-ДНК инсерционного мутагенеза wt ЭМС-мутаг енез 10 лепестков, 4 чашелистикаp. BR 322 NPTII LB RB агробактериальная трансформация семян отбор K m R растений с фенотипом agamous LB RBS ST- ДНК дизрупированный ген AGмутант ag-2 клонирование последовательности в E. coli RBSp. BR 322 Amp R трансформация мутанта ag-2 трансформированное растение с цветками дикого типа мутант ag-

Ген, маркированный транспозоном ( tagged gene) ,  можно клонировать с помощью  «вытягиванияГен, маркированный транспозоном ( tagged gene) , можно клонировать с помощью «вытягивания за транспозон»

Транспозонный мутагенез интеграция    изменение структуры  …. изменение транспозона  Транспозонный мутагенез интеграция изменение структуры …. изменение транспозона одного из генов…. фенотипа Возможность клонировать ген, «вытянув» его за транспозон

При встраивании транспозона в кодирующую последовательность гена,  наблюдается мутантный фенотип.  При вырезанииПри встраивании транспозона в кодирующую последовательность гена, наблюдается мутантный фенотип. При вырезании фенотип восстанавливается

Клонирование генов на основе транспозонного (инсерционного) мутагенеза  Реверсии к дикому типу – результатКлонирование генов на основе транспозонного (инсерционного) мутагенеза Реверсии к дикому типу – результат выхода транспозона из гена (нерепликативного перемещения транспозонов растений) Наличие ревертантных секторов – свидетельство того, что мутация вызвана инсерцией транспозона. Транспозон Инвертированные повторы Участок, кодирующий транспозазу Транспозаза Новое местоположение в ДНК

у мутанта floricaula (flo)  вместо цветков развиваются побеги Antirrhinum majus (L. ) floricaulaу мутанта floricaula (flo) вместо цветков развиваются побеги Antirrhinum majus (L. ) floricaula wild type Клонирование генов на основе транспозонного (инсерционного) мутагенеза

Получение мутации  flo 613 и клонирование гена FLORICAULA львиного зева ( Coen etПолучение мутации flo 613 и клонирование гена FLORICAULA львиного зева ( Coen et al. , 1990) 1. Выращивание 26 000 растений львиного зева с активным мобильным элементом Tam 3 (Transposone of Antirrhinum majus) при t º =15 º C , вызывающей наибольшую частоту транспозиций (растения М 1 ). 2. Самоопыление растений М 1 с целью выявления рецессивных мутаций, возникших в М 1 в результате перемещения Tam 3. 3. Выявление 15 разных гомеозисных мутаций среди 80 000 растений М 2 , в том числе и flo 613. 4. Укоренение и вегетативное размножение веточек мутанта flo 613 при t º =15 º C , для выявления реверсий. Генетический анализ.

 •  Рестрикционный анализ ДНК из выделенных клонов,  необходимый для выявления участков • Рестрикционный анализ ДНК из выделенных клонов, необходимый для выявления участков растительной ДНК, фланкирующих транспозон • Субклонирование растительной ДНК с целью дальнейшего использования в качестве пробы • Создание геномной библиотеки из растений дикого типа • Скрининг библиотеки с меченой пробой растительной ДНК, фланкирующей транспозон, для выявления клона, содержащего ген FLO • Доказательство того, что выявленные клоны содержат ген FLO

Создание геномной библиотеки из мутанта flo 613 , выращиваемого при t º = 2Создание геномной библиотеки из мутанта flo 613 , выращиваемого при t º = 2 5 º C (Т am 3 не перемещается) Изоляция ДНК Изоляция векторной ДНК Рестрикция ; Комбинирование растительной и векторной ДНК; Лигирование Amp R (ген устойчивости к антибиотику)Вставка растительной ДНК, содержащей ген интереса. Ген для цветной селекции Вставка растительной ДНК Трансформация бактерии Рост бактерии

Вектор с инсерцией растительной ДНК Вектор - пустышка Вектор с инсерцией растительной ДНК, Вектор с инсерцией растительной ДНК Вектор — пустышка Вектор с инсерцией растительной ДНК, содержащей ген интереса Амплификация бактерий, содержащих вектор с геном интереса Использованеи авторадиографии для локализации бактериальных колоний, содержащих ген интереса Реплика Блот с нитроцеллюлозным фильтром Лизис бактерий, денатурация. ДНК Гибридизация с радиоктивной меткой для выяления гена интереса. Экспозиция на чашке с селективной средой Скрининг библиотеки с меченой пробой из Tam 3 для выявления клонов, содержащих транспозон Получение отпечатков клонов библиотеки на нитроцеллюлозных фильтрах Гибридизация фильтров с меченой пробой (чаще – к. ДНК меченая Р 32 ) Авторадиография

   Д. т.  flo 613 9. 0 5. 5 1. 5 Д. т. flo 613 9. 0 5. 5 1. 5 Сравнение рестрикционных карт клонов, содержащих ген FLO, из геномной библиотеки мутанта и дикого типа Е Е Е Е Tam 3 ( 3. 5 kb) 5. 5 kb 1. 5 kb Блот-гибридизация по Саузерну (гибридизация ДНК мутанта и дикого типа с пробой растительной ДНК фланкирующей транспозон)

Ген FLORICAULA – уникальный ген,  присутствующий в геноме покрытосеменных в 1 копии. Ген FLORICAULA – уникальный ген, присутствующий в геноме покрытосеменных в 1 копии. Он кодирует белок, содержащий домены, характерные для белков – активаторов транскрипции (транскрипционных факторов): богатый пролином домен на N- конце и кислую область в середине белка. Наиболее активная экспрессия гена FLORICAULA наблюдается в закладыва-ющихся примордиях цветка. Клонирование гена открывает возможность для изучения роли кодируемого им белка и м. РНК во взаимодействии клеток

  Изучение механизмов регуляции экспрессии генов растений с использованием репортерных (индикаторных) генов Изучение механизмов регуляции экспрессии генов растений с использованием репортерных (индикаторных) генов Возможности метода: 1) Выявление факторов (внешних и внутренних), определяющих особенности экспрессии исследуемого гена 2) Выявление цис-регуляторных элементов гена, отвечающих на действие внешних и внутренних факторов

интрон ТАТА ATG Растительный ген ATG Бактериальный ген-репортер Слитые гены-репортеры. К промотору исследуемого генаинтрон ТАТА ATG Растительный ген ATG Бактериальный ген-репортер Слитые гены-репортеры. К промотору исследуемого гена присоединяют репортерный ген ТАТА ATG -растения Химерный белок

Green fluorescent protein (GFP) Luciferase (LUC)ß-glucuronidase  (GUS) Promoter-reporter fusion: Использование гибридных конструкций, содержащихGreen fluorescent protein (GFP) Luciferase (LUC)ß-glucuronidase (GUS) Promoter-reporter fusion: Использование гибридных конструкций, содержащих репортерный ген, «слитый» с промотором изучаемого гена — флуоресцентный белок — стабильный , — позволяет определить локализацию продукта на клеточном , тканевом уровне — не дает точной количественной оценки экспрессии (полуколичественный метод) — широко используется для изучения активности генов, т. к. позволяет выявить слабый уровень экспрессии — позволяет определить локализацию продукта на клеточном , тканевом уровне , белок стабильный, накапливается в тканях — не дает точной количественной оценки экспрессии (полуколичественный метод) — позволяет определить локализацию продукта на тканевом уровне , — дает наиболее точную количественную оценку — может использоваться для изучения динамических процессов (белок короткоживущий) p. CO: : GUSp. SCR: : GFP

В трансформированных растениях проводят анализ экспрессии репротерного гена, отбирают трансформантов с искомым характером экспрессииВ трансформированных растениях проводят анализ экспрессии репротерного гена, отбирают трансформантов с искомым характером экспрессии

Анализ распределение ауксина в растениях с помощью генетической конструкции DR 5: GUS DR 5Анализ распределение ауксина в растениях с помощью генетической конструкции DR 5: GUS DR 5 – синтетический ауксин-регулируемый промотор

Анализ активности промоторов ключевых регуляторных генов в меристемах растений Анализ активности промоторов ключевых регуляторных генов в меристемах растений

Получение растений со сверхэкспрессией гена с целью изучения функции гена Получение растений со сверхэкспрессией гена с целью изучения функции гена

Фенотип трансгенных растений 35 S: : LFY У растений 35 S: : LFY генФенотип трансгенных растений 35 S: : LFY У растений 35 S: : LFY ген LFY экспрессируется и в АМ, что приводит к ее превращению во ФМ и формированию терминальных цветков (закрытию соцветия)

Характер экспрессии генов-ортологов LFY/FLO может определять тип соцветия (открытое или закрытое) закрытое табак томат.Характер экспрессии генов-ортологов LFY/FLO может определять тип соцветия (открытое или закрытое) закрытое табак томат. Antirrhinum Arabidopsisоткрытое LFY

Метод позволяет изучить регуляторную функцию любого участка гена Направленный мутагенез промоторной области гена LFYМетод позволяет изучить регуляторную функцию любого участка гена Направленный мутагенез промоторной области гена LFY позволил обнаружить цис-элемент CAACTGTC , делеция которого полностью прекращала транскрипцию репортера ML 1 : : YVCVMP : GFPA ML 1: : GFP: LFYΔ 1 ML 1: : GFP: LFYΔ 2 ML 1: : GFP: LFYΔ 3 GFP: LFYΔ 1 GFP: LFYΔ 2 GFP: LFYΔ 3 GFP: LFY B DCA ATG ATG стоп. B P X S H B P X S H GFP LFY

lfy-26 Мутант арабидопсиса по гену LFY lfy-26 Мутант арабидопсиса по гену LFY

29 Основные семейства транскрипционных факторов растений Консервативные для эукариот: Уникальные для растений: ТФ с29 Основные семейства транскрипционных факторов растений Консервативные для эукариот: Уникальные для растений: ТФ с MADS- доменом ТФ с гомеодоменом ТФ MYB ТФ b. ZIP etc. ТФ GRAS ТФ AP 2 -like ТФ с В 3 -доменом ТФ с GARP/ARRM- доменом etc. MY

30 Гомеодомен-ДНК - комплекс вариабельный уч. гомеодомен N ССтруктура транскрипционного фактора с ДНК-связывающим гомеодоменом30 Гомеодомен-ДНК — комплекс вариабельный уч. гомеодомен N ССтруктура транскрипционного фактора с ДНК-связывающим гомеодоменом

31 31   Гены семейств KNOX ( STM) и WOX (WUS) кодируют гомеодомен-содержащие31 31 Гены семейств KNOX ( STM) и WOX (WUS) кодируют гомеодомен-содержащие транскрипционные факторы Гены семейства KNOX арабидопсиса Гены WOX арабидопсиса и других растений

ТФ с гомеодоменами ( семейство TALE) KNOX мишени:  гены биосинтеза ЦК и ГКТФ с гомеодоменами ( семейство TALE) KNOX мишени: гены биосинтеза ЦК и ГК программы развития: 1). Развитие ПАМ 2). Развитие сложного листа stm 35 S: : KNAT 1 HD-ZIPIIIWOX мишени: 1). гены ТФ KANADY ( антагонисты HD-ZIPIII ) 2). гены PIN (регулируют транспорт ауксинов) программы развития: Адаксиально-абакс иальная симметрия листаphb WT WTвышележащие регуляторы: система CLAVATA мишени: гены ARR-A — репрессоры ответа на ЦК ( для WUS ) программы развития: 1). Идентичность зародыша и суспензора ( WOX 2 и WOX 8 ) 2). Идентичность ПАМ и КАМ ( WUS и WOX 5 ) WUS WOX 5 WOX 8 WOX

Ген  KNOTTED 1 был идентифи-цирован на основе доминантных мутаций kn 1,  вызывающихГен KNOTTED 1 был идентифи-цирован на основе доминантных мутаций kn 1, вызывающих отсутствие лигулы и появление узелков ( knots ) на листьях, особенно вокруг жилок. В связи с доминантностью мутаций судить о функции гена сложно

Зная о важной роли гомеобоксных генов в развитии животных,  приступили к клонированию иЗная о важной роли гомеобоксных генов в развитии животных, приступили к клонированию и изучению KNOTTED 1 -подобных генов (KNOX -гены knotted 1 -like homeobox-containing) в растениях По гомологии с KN 1 клонированы другие гомеобоксные гены кукурузы (более 13), A. thaliana (7), табака, томатов, сои, риса, ячменя и др. Э ксп ресси рую тся тол ьк о в А М п обега KN 1 OSH 1 RS 1 KNOX 4 KNAT 1 KNOX 8 KNOX 3 SBH 1 KNAT 2 KNOX 10 LG 3 KNOX 5 KNOX 11 KNOX 2 KNOX 6 KNOX 7 BNHD 1 ATH 1 PNX-1 Кукуруза Рис Кукуруза Резушка Кукуруза Соя Резушка Кукуруза Кукуруза B. napus Резушка Человек Класс II Другие Helix IIIturn

Сверхэкспрессия гена KNAT 1 у арабидопсиса На листьях возникали дополнительные меристематические очаги, из которыхСверхэкспрессия гена KNAT 1 у арабидопсиса На листьях возникали дополнительные меристематические очаги, из которых могли возникать почки и побеги Листья A. thaliana 35 S: : KNAT 1 превращаются из простых в пальчаторассеченные, хотя фенотип сильно варьировал ( Chuck, Linkoln, Hake, 1996)

Сверхэкспрессия гена KNAT в листьях томатов дикий тип 35 S: : KNAT Сверхэкспрессия гена KNAT в листьях томатов дикий тип 35 S: : KNAT

KNOTTED - подобные гены – возможные участники морфологической эволюции растений KNOTTED — подобные гены – возможные участники морфологической эволюции растений

Обнаружение связи между уровнем экспрессии KNOX -генов и усложнением структуры листа позволило предположить, Обнаружение связи между уровнем экспрессии KNOX -генов и усложнением структуры листа позволило предположить, что эти гены могли участвовать в формировании разных типов листа у видов с простым листом (арабидопсис, табак, кукуруза, рис) KNOX- гены экспрессируются только в АМ, но не в примордиях листьев; у томата, имеющего сложный лист, эти гены экспрессируются и в примордиях листьев

39 M CM 1 – регулятор транскрипции дрожжей A G – гомеозисный ген арабидопсиса39 M CM 1 – регулятор транскрипции дрожжей A G – гомеозисный ген арабидопсиса (класс С) D EF –гомеозисный ген львиного зева (класс В) S RF – регулятор транскрипции человека 57 а / к CN Ceratopteris (CRMl) Antirrhinum (DEFICIENS) Arabidopsis (AGL-15) Consensus (Plants) Структура белков, содержащих MADS -домены

ТФ с MADS доменом вышележащие регуляторы: ТФ LFY мишени: ? ? ?  программыТФ с MADS доменом вышележащие регуляторы: ТФ LFY мишени: ? ? ? программы развития: развитие органов цветка AP 1, AP 3, PI, AG, SEP 1, 2, 3 SOC 1, FLC , CAL вышележащие регуляторы: 1). ТФ FT 2). Белки FCA и FY 2). Polycomb- комплекс VRN мишени: ген ТФ LFY программы развития: развитие флоральной меристемы PHERE S вышележащие регуляторы: Polycomb- комплек с FIS мишени: ? ? ? программы развития: развитие зародыша и эндосперма

Исследования трансгенных растений с конститутивной экспрессией гомеозисных генов также доказывают верность  АВС-модели 35Исследования трансгенных растений с конститутивной экспрессией гомеозисных генов также доказывают верность АВС-модели 35 S: : AP 3 35 S: : PI 35 S: : AG A В С Л Л Т Т В С Т Т

A   В  С  Л Л  Т  П ЦветкиA В С Л Л Т П Цветки с двойным венчиком (лилейные) Ч Ч Т ПA В С Цветки с двойной чашечкой Мутации в АВС- генах приводят к формирова-нию цветков разной структуры за счет изменения характера экспрессии этих генов (изменения доменов экспрессии в результате изменения уровня экспрессии, нарушения взаимодействий с другими регуляторными белками) Можно предполагать, что именно изменения характера экспрессии консервативных генов ортологов АВС лежат в основе всего разнообразия форм цветка покрытосеменных

Использование методов  «генетической хирургии» для изучения взаимодействия клеток и тканей в процессах развитияИспользование методов «генетической хирургии» для изучения взаимодействия клеток и тканей в процессах развития

Day, Galgoci, Irish, 1995.  Генетическое удаление лепестков и тычинок для выяснения роли клеточныхDay, Galgoci, Irish, 1995. Генетическое удаление лепестков и тычинок для выяснения роли клеточных взаимодействий в развитии цветка Модели, описывающие процесс возникновения органов цветка: «Последовательная» модель Wardlow, 1957. Порядок возникновения органов цветка отражает последовательность индуктивных сигналов (развитие органов каждого последующего круга зависит от сигналов, поступающих из предыдущих кругов

 «Пространственная» модель Holder, 1979.  Под влиянием позиционных сигналов происходит разметка ФМ, после «Пространственная» модель Holder, 1979. Под влиянием позиционных сигналов происходит разметка ФМ, после которой идет независимая дифференцировка органов цветка

В основе «генетической хирургии» лежит метод трансформации растений химерными генами следующей конструкции: 1. КодирующаяВ основе «генетической хирургии» лежит метод трансформации растений химерными генами следующей конструкции: 1. Кодирующая часть гена – последовательность, кодирующая продукт, вызывающий гибель растительных клеток и не способный перемещаться в другие клетки: а) ген Corynebacterium diphtheriae , кодирующий дифтерийный токсин DT-A -белок, который катализирует АДФ-рибозилирование фактора элонгации. Это ведет к ингибированию белкового синтеза и гибели клеток. В состав DT-A- белка не входит сигнальный пептид, белок не является секреторным, поэтому вызывает гибель только тех клеток, где ген экспрессируется;

b. гены,  кодирующие рибонуклеазы: Т 1 рибонуклеазу Aspergillus oryzae  и барназу Bacillusb. гены, кодирующие рибонуклеазы: Т 1 рибонуклеазу Aspergillus oryzae и барназу Bacillus amyloliquefaciens , вызывающие внутриклеточную деградацию РНК; c. ген peh. A из Burkholderia caryophilla PG 2982 – бактерии, метаболизирующей глицерол-глифосат до глифосата Глицерил-глифосат Гидролиз Глицерол + глифосат фосфонат-моноэстераза CH 2 CO O PO — O — NH Глифосат ( N — [ фосфонометил ]глицин ) Глифосат – гербицид, ингибирующий синтез ароматических аминокислот путем связывания с EPSP. Токсичен для растений, E. с oli и др.

Целью работы Day, Galgoci, Irish ( 1995 ) была проверка существующих моделей  сЦелью работы Day, Galgoci, Irish ( 1995 ) была проверка существующих моделей с использованием метода генетической хирургии Объекты: Arabidopsis thaliana и Nicotiana tabacum AP 3 DT-A NOSNOS 5 ’ 3’ 1. 7 т. п. н. AP 3 uid. A NOSNOS 5 ’ 3’ 1. 7 т. п. н.

Этапы работы 1. Слитые гены включали в Т-ДНК область  (фрагмент Ti -плазмиды, которыйЭтапы работы 1. Слитые гены включали в Т-ДНК область (фрагмент Ti -плазмиды, который передается растению) бинарного вектора p. BIADN и клонировали в E. coli Слитый ген NPTII – ген устойчивости к Kmori — прямые концевые повторы, фланкирующие Т-ДНК

1. У резушки получено 5 трансгенных растений, в геноме которых присутствовали от 1 до1. У резушки получено 5 трансгенных растений, в геноме которых присутствовали от 1 до 5 копий трансгенов (Саузерн-блоттинг) 2. Все трансгенные растения имели одинаковый фенотип: органы 2 и 3 кругов (лепестки и тычинки) отсутствовали, а чашелистики и пестики имели нормальную морфологию. Следовательно, разметка кругов начинается на ранних стадиях до экспрессии трансгена во ФМ, т. е. верна пространственная модель РЕЗУЛЬТАТЫ:

Использование трансформации для изучения роли гормонов в развитиии растений Использование трансформации для изучения роли гормонов в развитиии растений

Онкогены Ti и Ri плазмид Ti плазмида Agrobacteriuim tumefaciens Т-ДНК vir область 5 iaa.Онкогены Ti и Ri плазмид Ti плазмида Agrobacteriuim tumefaciens Т-ДНК vir область 5 iaa. H iaa. M ipt 6 a 6 b (tms 2) (tms 1) (tmr) (tml) Биосинтез ауксинов Биосинтез цитокининов Точная функция неизвестна, предположительно связана с метаболизмом ауксинов и цитокининов Т-ДНК Ti -плазмиды oriкатаболизм опина Ri плазмида Agrobacterium rhizogenes rol. A rol. B rol. C ORF 13 ORF 14 rol. D Повышение чувствительности раст. клеток к ауксину Повышение чувствительности раст. клеток к цитокинину. Т-ДНК Ri -плазмиды Точная функция неизвестна, предположительно связана с метаболизмом ауксинов и цитокининов

Корончатый галл на растении табака как результат трансформации агробактерией (штамм дикого типа) Корончатый галл на растении табака как результат трансформации агробактерией (штамм дикого типа)

Трансгенные рстения с геном tmr Трансгенные рстения с геном tmr

Ген tmr в трансгенных растениях,  экспрессирующийся в плодах (промотор 2 А 11) Ген tmr в трансгенных растениях, экспрессирующийся в плодах (промотор 2 А 11)

Опухолеобразование у редиса – генетический признак 1, 3324128 х16* 0, 0946146 х10* 1, 41501118Опухолеобразование у редиса – генетический признак 1, 3324128 х16* 0, 0946146 х10* 1, 41501118 х21* 1, 261716718 х19* 0, 0119618 х16* 2, 0015918 х10* 2 (1: 3)Опухоль — Опухоль +Гибрид

Фенокопии опухолеобразования у трансгенных растений с геном ipt на корнеплоде интактных растений у растенийФенокопии опухолеобразования у трансгенных растений с геном ipt на корнеплоде интактных растений у растений in vitro на среде с БАП ipt npt. II

Прямая генетика :  фенотип     ген Обратная генетика : генПрямая генетика : фенотип ген Обратная генетика : ген фенотип. Прямая и обратная генетика в изучении функции гена

- гомологичная рекомбинация / замещение гена -замещение гена: альтернативные подходы ( Zn-fingers nucleases, — гомологичная рекомбинация / замещение гена -замещение гена: альтернативные подходы ( Zn-fingers nucleases, TALEN) — РНК-интерференция / генный сайленсинг — T- ДНК-инсерционный мутагенез /T-DNA tagging — TILLING ( Target Induced Local Leisons IN Genomes)Подходы, используемые обратной генетикой :

TALE :  TAL (transcription activator-like) effectors Эффекторы TALE – регуляторные белки,  секретируютсяTALE : TAL (transcription activator-like) effectors Эффекторы TALE – регуляторные белки, секретируются бактериями Xanthomonas ( патогены растений) с помощью механизма секреции III типа. TALE – оказывают влияние на экспрессию генов растения-хозяина, тем самым обуславливая восприимчивость или устойчивость к заболеванию Kay et al. 2009 Avr. Bs 3 – связывается с UPA-box , активируют гены-мишени – в т. ч. Bs 3 , запускающий реакцию СВЧ

Основные типы замолкания гена (сайленсинга) п ост - транскрипционн ый сайленсинг (регуляция экспресии генаОсновные типы замолкания гена (сайленсинга) п ост — транскрипционн ый сайленсинг (регуляция экспресии гена на уровне трансляции) PTGS — P ost-transcriptional gene silencing транскрипционный сайленсинг (регуляция экспрессии гена на уровне транскрипции) TGS — Transcriptional gene silencing Специфическое разрезание м. РНК (А) Репрессия трансляции (В) Метилирование гистонов, гетерохроматинизация (С)

Белки,  участвующие в метаболизме  «малых» РНК у растений •  DCL 1Белки, участвующие в метаболизме «малых» РНК у растений • DCL 1 (DICER-like) – рибонулеказа, участвующая в процессинге mi. RNA • HYL 1 (HYPONASTIC LEAVES) ядерный ds. RNA-связывающий белок HEN 1 (HUA ENHANCER 1) HEN 1 и HYL 1 участвуют в ядерном процессинге «малых» РНК • HST (HASTY) – гомолог экспортина, участвует в транспорте mi. RNA из ядра в цитоплазму • AGO (ARGONAUTE)- рибонуклеаза, компонент RISC ( RNA-induced silencing complex)

Пример: выключение (сайленсинг) гена  «икс» конститутивный (35 S) регулируемый (индуцибельный) Интроны промотор иксПример: выключение (сайленсинг) гена «икс» конститутивный (35 S) регулируемый (индуцибельный) Интроны промотор икс ски ds. RNA RISC – RNA-induced silencing complex. DICER- подобная рибонуклеаза m. RNA деградация транскрипта, репрессия трансляции. Конструкция, используемая для трансформации

Регулируемое замолкание гена PDS (PHYTOENE DEASATURASE) LBRB RB LB 35 S Lh. GR GUSopРегулируемое замолкание гена PDS (PHYTOENE DEASATURASE) LBRB RB LB 35 S Lh. GR GUSop NPTIINos NPTIIPDS intronp. HELLSTOP PDS- PHYTOENE DEASATURASE оператор b- глюкоронидаза. Нет ИНДУКТОРА Добавление ИНДУКТОРА : + DEX дексаметазон ( стероидный лиганд ) Lh. GR – транскрипционный фактор (ТФ) Неактивный ТФ HSP 90 LBRB RB LB 35 S Lh. GR GUSop NPTIINos NPTIIPDS intron Экспрессия b -глюкоронидаз ы (репортерного гена) Lh. GRАктивный ТФЭкспрессия PDS — ингибирующей конструкции DEXСайленси нг гена PDS

Регулируемое замолкание (индуцибельный сайленсинг) гена PDS ( PHYTOENE  DEASATURASE ) No Dex Регулируемое замолкание (индуцибельный сайленсинг) гена PDS ( PHYTOENE DEASATURASE ) No Dex

  Enhancer TATA En En  Enhancer TATA 3. Enhancer trap ( ловушка Enhancer TATA En En Enhancer TATA 3. Enhancer trap ( ловушка для энхансера) 2. Activation tag ( активирующая последовательность)1. Геномная ДНК дикого типа Примеры использования Т-ДНК в качестве «зондов» для выявления кодирующих и регуляторных областей (Т- DNA tagging ) TATA reporter gene Scholte M. T-DNA tagging in Medicago truncatula.

 Инсерционный мутагенез с использованием «ловушек» промоторов Репортерный ген без промотора встраивают в Т-ДНК Инсерционный мутагенез с использованием «ловушек» промоторов Репортерный ген без промотора встраивают в Т-ДНК векторной Ti -плазмиды. Растения трансформируют с помощью агробактерии, отбирают трансформантов по маркерам Т-ДНК. Экспрессия репорт. гена в растении возможна при встраивании внутрь транскрипционной единицы в правильной ориентации Геномная ДНК Ловушка промоторов. Энхансер ТАТА м. РНКЭнхансер ТАТА

  Enhancer TATA 4.  Ловушка для промотора ( promoter trap) -1 reporter Enhancer TATA 4. Ловушка для промотора ( promoter trap) -1 reporter gene гибрид ный белок Инсерция в экзон Enhancer TATA 5. Ловушка для промотора ( promoter trap) -2 reporter gene гибрид ный белок Инсерция в интрон SD SA Splice aceptor sequence сплайсинг Scholte M. T-DNA tagging in Medicago truncatula. 2002 Примеры использования Т-ДНК в качестве «зондов» для выявления кодирующих и регуляторных областей (Т- DNA tagging )

Принцип работы  «ловушки для энхансеров»  GAL 4: GFPПримеры  использования Т-ДНК вПринцип работы «ловушки для энхансеров» GAL 4: GFPПримеры использования Т-ДНК в качестве «зондов» для выявления тканеспецифичных энхансеров

Методы редактирования генома растений Методы редактирования генома растений

Модификации генома:  разновидности Изменение случайного места в геноме Редактирование генома Модификации генома: разновидности Изменение случайного места в геноме Редактирование генома

Редактирование генома Инактивация конкретного локуса Замена одного локуса на другой с помощью гомологичной рекомбинацииРедактирование генома Инактивация конкретного локуса Замена одного локуса на другой с помощью гомологичной рекомбинации (HR) Этот путь затруднён у растений. Введение DSB также существенно увеличивает вероятность гомологичной рекомбинации. Чтобы инактивировать конкретный локус, надо осуществить в нём разрыв двунитевой ДНК ( DSB)

Программируемые нуклеазы • ZFN  (Zink-Finger Nucleases) • TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) •Программируемые нуклеазы • ZFN (Zink-Finger Nucleases) • TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) • CRISPR-Cas система (Clustered regularly Interspaced Palindromic Repeats- CRISPR associated protein)

Нуклеазы с цинковыми пальцами В качестве ДНК-связывающего домена используется универсальный домен типа «Цинковые пальцы»Нуклеазы с цинковыми пальцами В качестве ДНК-связывающего домена используется универсальный домен типа «Цинковые пальцы»

Как программируют ZFN? Wolfe et al. , 1999 • Каждый цинковый палец распознаёт 3Как программируют ZFN? Wolfe et al. , 1999 • Каждый цинковый палец распознаёт 3 (4) нуклеотида. Обычно используют 3 -6 пальцев. • Можно подбирать цинковые пальцы под последовательности • Обычно хорошо режутся не все последовательности, а только GNN. ( т. е. , например, 9 -нуклеотидная последовательность должна быть GNNGNNGNN) • В среднем хорошая специфичная последовательность для разрезания попадается один раз на 100 нп.

TALEN (Transcription Activator-Like Effectors Nucleases) TALEN (Transcription Activator-Like Effectors Nucleases)

TALEN Kim, 201433 -35 аминокислотные повторы 12 ый -13 ый аминокислотные остатки (repeat variableTALEN Kim, 201433 -35 аминокислотные повторы 12 ый -13 ый аминокислотные остатки (repeat variable diresidues) связываются с определённым нуклеотидом

Применение TALEN Потеря функции гена LOX 3 ( кодирует липоксигеназу,  создающую перекись водорода)Применение TALEN Потеря функции гена LOX 3 ( кодирует липоксигеназу, создающую перекись водорода) увеличивает сроки хранения семян Этот ген инактивировали с помощью TALEN Ma et al. , 2015 Рис дикого типа Рис lox 3 После обработки для ускоренного старения

Система CRISPR/Cas 9 (Clustered regularly Interspaced Palindromic Repeats- CRISPR associated protein) Система CRISPR/Cas 9 (Clustered regularly Interspaced Palindromic Repeats- CRISPR associated protein)

Система CRISPR/Cas 9 • В 2005 обнаружили, что спейсеры гомологичны последовательностям фагов и конъюгативныхСистема CRISPR/Cas 9 • В 2005 обнаружили, что спейсеры гомологичны последовательностям фагов и конъюгативных плазмид ( Mojica et al. , 2005) • Streptococcus thermophilus : Устойчивость к фагам коррелировала с составом спейсеров ( Barrangou et al. , 2007 ) • Гены cas тоже необходимы для устойчивости ( Barrangou et al. , 2007 )

Работа системы CRISPR-Cas в бактериях Horvath,  Barrangou,  2010 Работа системы CRISPR-Cas в бактериях Horvath, Barrangou,

Čermák et al. , 2015 Čermák et al. ,

Защита от вирусов с помощью CRISPR-Cas 9 Ji et al. , 2015 Защита от вирусов с помощью CRISPR-Cas 9 Ji et al. ,

Рецептор ауксина Auxin binding protein 1 (ABP 1) Chen et al. , 2001 Рецептор ауксина Auxin binding protein 1 (ABP 1) Chen et al. ,

Gao et al. ,  201 5 Gao et al. ,

Рецептор ауксина Auxin binding protein 1 (ABP 1) Chen et al. , 2001 Рецептор ауксина Auxin binding protein 1 (ABP 1) Chen et al. ,

Зарегистрируйтесь, чтобы просмотреть полный документ!
РЕГИСТРАЦИЯ