Биотехнология растений Лекция 2 Клеточная селекция I

Биотехнология растений

Лекция 2. Клеточная селекция I. Основные принципы и этапы клеточной селекции II. Методы клеточной селекции III. Позитивная (прямая) клеточная селекция IV. Опосредованная клеточная селекция V. Негативная клеточная селекция

Принципы клеточной селекции Мутагенез (радиоционный, химический) Исходный эксплант . Отбор на уровне клеток Культура Суспензионная протопластов культура Каллусная культура . Отбор мутантов . Регенерация растения . Мутантное растение . Ретестирование in vitro Отбор на уровне целых растений Генетический анализ Тестирование нового (R 1, R 2) генотипа

Мутагенез in vitro Основные мутагены, используемые в клеточной селекции и некоторые аспекты их применения Химические Физические 1. Этилметансульфонат (ЭМС) 1. γ-излучение. Используется для получения ауксотрофов, 2. N-метил-N-нитро-Nмутантов устойчивости к нитрозогуанидин (НГ). гербицидам и валину Применяется для получения 2. УФ-излучение. Хорошо мутантов устойчивости к зарекомендовала себя при аналогам аминокислот, к аналогам получении некоторых нуклеиновых кислот; для ауксотрофов и мутантов получения некоторых ауксотрофов устойчивости к валину 3. N-этил-N-нитрозомочевина (НЭМ). Используется для получения мутантов устойчивости к хлорату, аналогам аминокислот; для получения мутантов, дефектных по нитроредуктазе 3. Рентгеновское излучение. Применяется для получения пигменто-дефектных мутантов

Получение протопластов или проросток Нарезать н Клеточная стенка цитоплазма Раствор, содержащий вакуоль целлюлазу, сахар и ядро соли а фрагмент лист ы и вание ие Отмы ирован рифуг цент протопласты Колония Фильтровальная протопластов бумага Обломки клеточных стенок Питательная среда ву а в поч к ересад недели П через 3 Растение-регенерант Плазматическая мембрана Пересадка колоний через 2 -3 недели побегообразование Клетки-няньки впаены в среду ка Среда с высоким есад ля ер П содержанием гов д я цитокининов и низким побе нени е ауксинов укор 4 недели рез 2 че Среда без цитокининов и низким содержанием ауксинов

Позитивная клеточная селекция Растение дикого типа Отбор на устойчивость к селективному агенту на уровне микрокаллуса Биотест с фитофторой Индукция каллусогенеза Селекция устойчивых форм Регенерация

Примеры позитивной клеточной селекции 1 а. Устойчивость к селективному агенту на уровне: Устойчивость на уровне растения Трансгенные растения Устойчивость на клеточном уровне wt MS 0+Km Nicotiana tabacum MS 0+нистатин (сублетальная концентрация) Протопласты картофеля

1 б. Устойчивость к полиеновым антибиотикам A. Каллусы табака на среде не содержащей селективный агент; Б. Каллусы табака на среде, содержащей летальную концентрацию нистатина; B. Каллусы табака на концентрацию нистатина. среде содержащей сублетальную

Устойчивость к аминокислотам и их аналогам Биосинтез аминокислот, производных аспартата Аспартат Β-аспартилфосфат Аспарагиновый β-полуальдегид DHDPS Гомосерин Треонин Изолейцин 2, 3 -дигидропиколинат Метионин Лизин Ингибирование по принципу обратной связи AK AK - аспартаткиназа; DHDPS - синтаза дигидропиколиновой кислоты

Опосредованная клеточная селекция Получение растений, устойчивых к насекомым и грибам Растение дикого типа Отбор на устойчивость к полиеновым антибиотикам на уровне микрокаллуса Индукция каллусогенеза Регенерация

Гидрофильный слой Гидрофобный слой Холестерол Кампестерол Ситостерол Основные стерины Стигмастерол Фосфотидилэтаноламин Фосфотидилхолин Расположение в мембране Холестерол

Вещества, изменяющие состав стеринов Нистатин O CH 3 O OH OH OH Полиеновый антибиотик Образует комплексы со стеролами в клеточной мембране; приводит к изменению проницаемости мембраны и возможной гибели клетки OH CH 3 O OH CH 3 Филлипин Ингибиторцитохром P-450 -зависимой монооксигеназы, которая удаляет С-14α метильную группу в процессе стерольного биосинтеза; приводит к накоплению С-14α метилстеролов OH Cl O CH CH 3 CH C CH 3 N N OH CH 3 OH OH OH Фунгицид Состав: 25% тридименола 3% фуберидазола NH 2 COOH OH O CH 3 O OH OH Полиеновый антибиотик Состав: филлипин III смесь 4 х макролидов OH Связывает стерины с образованием крупных плоских агрегатов между бислоями, что приводит к разрушению мембраны; комплексфиллипин-стерин локализуется в верхнем билипидном слое и вызывает деформацию мембраны N Байтан CH 3

Получение растений с измененным содержанием стеринов Спектр растения дикого типа Спектр 13/5 растения Процесс регенерации Спектры основных стеролов: Растение-регенерант (табак) 1. Холестерол, 2. Кампестерол, 3. Стигмастерол, 4. Ситостерол, 5. 24 -метилен циклоартенол, 6. Циклоартенол, 7. D 7 -кампестерол, 8. D 7 -ситостерол, D 7 -авенастерол, 10. 24 -этилдиен лофенол

Количество выращенных имаго Модель табак- дрозофила Растение Каллус Диаграмма фертильности Drosophilla на среде содержащей гомогенат нистатин -устойчивых растений табака

Модель табак- дрозофила Развитие яичников Drosophilla в норме (слева) и при стерольной диете (справа)

Модель картофель - фитофтора Устойчивые к P. infestans растения картофеля линии Rf 18 Биотест in vitro: 2 -5 растения с различным уровнем чувствительности Устойчивые растения Биотест in vivo Контроль

Пропорция основных стеролов в листьях исходного сорта Пушкинец-1 и устойчивого к фитофторозу (Rf 18) растения картофеля (количество холестерола принято за 1) Rf 18 Пушкинец-1 Холестерол Растение Ситостерол Кампестерол

Фенотип “dwarf” растений картофеля, устойчивых к филлипину “Dwarf” растение картофеля линии Rb 3 (слева) и растение дикого типа (справа) Цветки Rb 3 растения (в середине) и цветки растения дикого типа (по бокам)

Молекулярно-генетические механизмы устойчивости растений к вредителям сельского хозяйства Типы устойчивости: 1) Видовая устойчивость (иммунитет) – устойчивость к подавляющему числу патогенов 2) Сортоспецифическая устойчивость – поражаются отдельные сорта (генетипы) не

Мучнистая роса Разнообразие патогенов Крапчатый вилт Антракноз Корневая нематода Бактериальная сыпь Вирус мозаики томата Fusarium вилт Корончатый галл

Botrytis cinerea, возбудитель серой гнили, споруляция на винограде

Методы биотехнологии и получения устойчивых растений Трансгенный подход Клеточная селекция Растение дикого типа Отбор на устойчивость к селективному агенту (токсин) на уровне микрокаллуса Индукция каллусогенеза Маркерная линия Регенерация Получение устойчивой линии требует несколько поколений бэкроссов

Негативная клеточная селекция

Частота возникновения ауксотрофных клонов у N. plumbaginifolia Доза, * гр 13 Число (частота) Выживаемость, ** % тестируемых ауксотрофов клонов 57 3727 0 16 23 3705 0 19 15 2377 0 23 11 4420 3(8 • 10 -3) * γ-лучи (60 Со-пушка, 0, 042 гр/с) ** эффективность высева необлученных протопластов 70%

Соматическая гибридизация

Соматическая гибридизация – способ получения соматических гибридов в результате слияния протопластов разных видов ( ФОРМ).

Техника получения соматических гибридов. • 1. Изоляция протопластов • 2. Слияние протопластв различных форм. • 3. Идентификация и селекция соматических гибридных клеток. • 4. Культивирование гибридных клеток. • 5. Регенерация гибридных растений

• Методы изоляции протопластов из растительных тканей. ) 1. Механический метод 2. Энзиматичекий метод

1. Механический метод Плазмолиз Ткани растений п ко с о р ик нн а йм ы в о ир т р ве Ин Надрезы клеточной стенки Выход протопластов Отбор протопластов

Идентификация и селекция соматических гибридов • идентификация гибридов основана на различиях между родительскими и гибридными клетками • пигментация • цитоплазматические маркеры (наличиеотсутствие хлоропластов) • использование ауксотрофных мутантов • . физиологические различия родительских клеток

селекция гибридных клеток (используемые маркеры ) генетическая комплементация гормонезависимость по гормонам ауксотрофные мутанты и мутанты по метаболизму • анализ хромосом • • •

• Identification of the somatic hybrids using RAPD analysis 1 2 M h h h

• изучение генов цитоплазматических детерминант • анализ групп сцепления хлоропластов и митохондрий • получение уникальных гибридов с разным сочетанием ядерных генов и генов цитоплазматических детерминант

• Genome composition of the BC 2 hybrid (AAAE) AAA • determined by using GISH analysis • 4 х=(39 potato chromosomes) and (12 S. etuberosum chromosomes) chromosomes • BC 2 hybrid derived from the sexual crosses of potato and • interspecific somatic hybrid • Solanum tuberosum (genome A) (+) S. etuberosum (genome E)

PVY-infected potato plants ( ) and resistant ( ) field growing somatic hybrids Solanum tuberosum (+) Solanum etuberosum

использование соматических гибридов • получение новых межвидовых гибридов – Pomato (гибрид картофеля и томата) • получение фертильных диплоидов и полиплоидов от стерильных гаплоидов, триплоидов и анеуплоидов • перенос генов интереса, например, устойчивости от дикорастущих форм к культурным