BIOTECHNOLOGY MOLECULAR ASPECT OF EARLY CANCER DIAGNOSTICS AND

BIOTECHNOLOGY: MOLECULAR ASPECT OF EARLY CANCER DIAGNOSTICS AND THERAPY. 16 -17 September, 2015. Barnaul «Цифровые» подходы к детекции соматических мутаций в опухолях Филипенко М. Л. , зав. лаб. фармакогеномики, ИХБФМ СО РАН

мутации ДНК (структурные варианты) Генеративные Соматические (структурный полиморфизм генома человека) Изменение ДНК в соматических клетках (мутация присутствует, например, только в клетках опухоли) Тело человека содержит приблизительно 1013 - 1014 клеток. Средняя скорость мутационного процесса 1 на 109 на одно деление. Это означает, что наше тело содержит значительный спектр соматических мутаций. PS. Это, конечно же, очень условная оценка

Диагностическое применение детекции соматических мутаций: Субтипирование опухоли для определения ее молекулярного типа (назначения таргетной терапии) - опухоль в качестве источника ДНК - плазма крови, моча, слюна Мониторинг эффективности терапии Диагностика онкологических заболеваний, желательно неинвазивная Для эффективной клинически неинвазивной идентификации мутаций, необходимо достижение большей чувствительности предела обнаружения (<1% аллельной частоты).

Распространение методы выявления соматических мутаций: Фоновый сигнал выявления мутации Секвенирование на ДНК дикого Аллель-специфичная ПЦР типа!!! Различные модификации Taq-man p. H 1047 L c. 3140 A>T 70% B A p. E 545 L c. 1634 A>C 10%

Образец ДНК 2 Образец ДНК 1 распределение единичных молекул ДНК по компартментам real-time PCR PCR Ct = 19 Ct = 20 R 0 S 1 / R 0 S 2 = (1 + E)∆Ct s …. . N = в два раза больше! N=2 N=4 N = что-то типа четырех

История развития Sykes, PJ; Neoh SH, Brisco MJ, Hughes E, Condon J, Morley AA (1992). "Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution". Biotechniques 13 (3): 444– 9. Kalinina O, Lebedeva I, Brown J, Silver J (1997). "Nanoliter scale PCR with Taq. Man detection". Nucleic Acids Research 25 (10): 1999– 2004. US Patent 6, 143, 496; Cytonix

Полное описание принципа, метода и его применение! PCR выполнялся в объеме 7 мкл в 96 -луночном планшете. 96 -луночная плашка и 50 эквивалентов генома на плашку (~75 пг ДНК) было использовано для анализа мутантной (гетерозигота) по K-RAS линии клеток. Авторами впервые проведен неинвазивный анализ образцов кала на предмет наличия ДНК с соматическими мутациями в 12 кодоне гена Ki. Ras. В этом случае для детекции более низкой пропорции мутантной ДНК (1– 10%) использовали четыре плашки (384 Dig-PCR).

Существующие технологии проведения «цифровой» ПЦР - использование стандартных приборов и пластика (исторический вариант Vogelstain and Kinzler) - нестандартные многоячеечные емкости и приборы - получение и анализ большого количества микрокапель масло-водная фаза

стандартные пластик и приборы 96 - и 384 луночные плашки любые приборы для real-time PCR 96 -384 луночного формата нестандартные многоячеечные емкости и приборы Life Technologies, Open. Array®Plates 3, 072 through-holes Quanti. Studio Bio. Mark™ HD System, Fluidigm 12. 765 Digital Arrays Slip. Chip (Chicago), Spinning Disk Platform (Univ. Utach) и другие

Получение и анализ большого количества микрокапель масло-водная фаза Шейкирование, «ручной» микроскопический анализ полученных микрокапель Шейкеры 1000 – 12000 rpm, стандартные амплификаторы, эпифлюоресцентный микроскоп, стандартное мат. обеспечение для анализа имиджей, куча времени для упражнений по получению стабильной эмульсии и равномерному. Микрофлюидика для получения и анализа микрокапель Bio-Rad's QX 100 Droplet Digital PCR; 20000 points, two colors Rain. Dance Tech. , Rain. Drop™ Digital PCR System, 1 -10 million droplets, quantitative two colors

Разработка системы выявления соматических мутаций гена EGFR и сравнительный анализ с The therascreen EGFR RGQ PCR Kit (Qiagen) The characteristic of the analyzed samples with deletion in 19 exon EGFR gene The samples obtained from Number The Institute of Chemical 42 Biology and Fundamental Medicine SB RAS (Novosibirsk) The Moscow Oncological 37 Hospital 62 (Moscow) The Research Institute of 74 Oncology of Prof. NN Petrov (Saint Petersburg) DNA extraction (paraffin-embedded material) The phenol– chloroform extraction (home-made modification) QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) The method for detecting deletions Fragment length analysis, The therascreen EGFR RGQ PCR Kit Fragment length analysis

Результаты секвенирования выявленных делеций DNA sequence c. 2235 -2249 (d 15) с. 2236 -2250 (d 15) c. 2240 -2257 (d 18) c. 2239 -2248>C c. 2237 -2255>T c. 2238 -2252(del 15) c. 2239 -2251>C c. 2237 -2251(del 15) c. 2253_2276 del 24 c. 2240 -2251 (del 12) c. 2252_2276>A c. 2237 -2252>T c. 2237 -2257 >TCT c. 2235 -2255>AAT c. 2236 -2248>CAAC c. 2237 -2251>TTC c. 2237 -2251>CAC c. 2239 -2253>СС c. 2239 -2263>GCAT c. 2240 -2265>CGAGAGAT c. 2240 -2264>CGAGAGA c. 2239 -2261>GC c. 2234 -2250>G n (our) 68 41 11 7 3 3 2 2 2 1 1 1 1 ID cosmic COSM 6223 COSM 6225 COSM 12370 COSM 12382 COSM 12384 COSM 23571 COSM 12383 COSM 12678 COSM 13556 COSM 6210 COSM 96856 COSM 12386 COSM 18427 COSM 12385 COSM 13557 COSM 18421 new new n (cosmic) 981 458 152 92 58 7 26 24 5 7 4 3 2 2 2 1 Protein sequence p. E 746_A 750 del. ELREA p. L 747_P 753>S p. L 747_A 750>P p. E 746_S 752>V p. L 747_T 751 del. LREAT p. L 747_T 751>P p. E 746_T 751>A p. S 752_I 759 del. SPKANKEI p. L 747_T 751>S p. T 751_I 759>N p. E 746_T 751>V p. E 746_P 753>VS p. E 746_S 752>I p. E 746_A 750>QP p. E 746_T 751>VP

Location of known 19 exon deletions, and primers/probes for dd. PCR assay. (b)

Principle of Taq. Man-based dd. PCR approach for detection of deletions in EGFR 19 exon. Region, common for deletions, is marked by green. c. 2235 -2249 (d 15) 10% c. 2236 -2248>CAAC - 1650

Cut-off ΔCt – 9. 06 Length, bp COSMIC ID Deletion c. 2239 -2251>C c. 2252 -2276>A 13>1 25>1 COSM 12383 COSM 96856 с. 2236 -2250 (d 15) c. 2240 -2257 (d 18) c. 2236 -2248>CAAC c. 2237 -2251(del 15) c. 2237 -2251>TTC c. 2237 -2252>T c. 2238 -2252(del 15) c. 2239 -2248>C c. 2240 -2251 (del 12) c. 2235 -2255>AAT c. 2237 -2255>T c. 2237 -2257>TCT c. 2235 -2249 c. 2253 -2276 15 18 13>4 15 15>3 21>3 15 9>1 12 21>3 19>1 21>3 15 24 COSM 6225 COSM 12370 COSM 13557 COSM 12678 COSM 18421 COSM 18427 COSM 23571 COSM 12382 COSM 6210 COSM 12385 COSM 12384 COSM 18427 COSM 6223 COSM 13556 c. 2239 -2253>СС c. 2237 -2251>CAC c. 2239 -2263>GCAT c. 2240 -2265>CGAGAGAT c. 2240 -2264>CGAGAGA c. 2239 -2261>GC c. 2234 -2250>G 14>2 15>3 25>4 26>8 25>7 23>2 17>1 New (unpublished) New (unpublished) Detection assay therascreen EGFR dd. PCR, mutation RGQ PCR Kit, ΔCt* % 3. 40 N/A 3. 00 5. 5 6. 8 0. 7 1. 2 4. 3 8 1. 4 2. 8 7. 8 2. 6 75. 0 36. 4 N/A 68. 0 39. 9 27. 5 93 94. 6 38. 7 5. 9 52. 5 62 8. 4 70. 6 72. 7 43. 4 50 2. 5 3. 4 2. 0 1. 8 3. 6 5 2. 5 54. 4 26. 7 49. 7 48. 8 44. 4 85. 4 80. 7

Корреляция dd. PCR и therascreen EGFR RGQ PCR Kit 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2 c. 2252 -2276>A c. 2253 -2276 c. 2239 -2261>GC c. 2237 -2257>TCT 4 6 8 25>1 COSM 96856 24 10 COSM 13556 23>2 21>3 New (unpublished) COSM 18427 In-house dd. PCR del-ex 19 characteristics: FPR=0. 6, T=4, LOD=0. 09%

Pseudodigital probe-based melt curve analysis Псевдоцифровой ПЦР для выявления соматических мутаций с использованием анализом кривых плавления Taq-man зонда

HEX-CTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAGAAAGA-BHQ Tm=64 мутация Tm=69 В ПЦР смесь добавляется Taq-man, комплиментарный нормальной последовательности гена. За счет наличия неспаренного основания зонд легче вытесняется полимеразой в ампликонах с мутацией, что обуславливает их селективное обогащение Гибридизация зонда с ампликоном увеличивает расстояние между флуорофором и гасителем, + F ампликон Нагревание и измерение флуоресценции Tm Tm MUT W -d. F/d. T Klen. Taq Т

PIK 3 CA H 1047 codon 3 2 1 Проверка чувствительности разработанной тестсистемы. В качестве матрицы ДНК, содержащая: 1 – 2%; 2 - 6 %; 3 - 18 % мутации. H 1047 codon KRAS G 12 codon зеленым – G 12 C 50% синим – G 12 С 1%, красным WT

NRAS Q 61 K синим – WT красным – Q 61 K 50% зеленым- образец из гистологического блока с мутацией Q 61 K оранжевым – образец с мутацией Q 61 R

N-RAS exon 3 Красный - Q 61 K (3%) 300 коп/лунку Черный - Q 61 K (0. 5%) 300 коп/лунку Зеленый- DNA-W Красный - Q 61 K (3%) 15 коп/лунку Зеленый- DNA-W Черный - Q 61 K (0. 5%) 15 коп/лунку Зеленый- DNA-W

lg concentration of of DNA in plasma samples (copies/m. L) Concentration of DNA in plasma samples 1. 00 E+07 1. 00 E+06 1. 00 E+05 1. 00 E+04 1. 00 E+03 1. 00 E+02 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 200 -1000 геном эквивалентов на 200 мкл плазмы Чувствительность 0. 1 -0. 2% мутантного аллеля при использовании 3248 лунок и нагрузке ДНК около 10 -15 геном-эквивалентов на лунку

http: //www. mycancergenome. org/

м. РНК микро. РНК белки метаболиты Все в цифру!

http: //www. olink. com/technology/pea-technology

Digital proximity extension analysis PSA 1 мкл плазмы развели в 106 в PBS, 2 мкл использовали для анализа

Спасибо за внимание! Н. В. Оськина, И. П. Оскорбин, Д. Г. Шамовская, Е. А. Храпов Лаб. фармакогеномики ИХБФМ СО РАН Е. Н. Имянитов, А. Г. Иевлева, Н. В. Митюшкина НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова, С. -Петербург И. А. Демидова, Лаборатория молекулярной биологии ГАУЗ МГОБ № 62 ДЗМ Н. Е. Кушлинский РОНЦ им. Блохина, Москва mlfilipenko@gmail. com +7 913 9217392

Superior doctors prevent the disease. Mediocre doctors treat the disease before evident. Inferior doctors treat the full blown disease. Huang Dee: Nai – Ching (2600 В. С. , 1 st Chinese Medical Text)