Биосинтетический путь (от ЭПР к аппарату Гольджи и

Биосинтетический путь (от ЭПР к аппарату Гольджи и через его цистерны) Места формирования транспортных везикул, наполненных грузом , c интезированным de novo — c айты выхода ( exit sites), — расположены на периферических участках тубул ЭПР, т. о. участок пути до аппарата Гольджи направлен от периферии в околоядерную область клетки Транс- сеть аппарата Гольджи — основная сортирующая станция на пути вновь синтезированных веществ Далее возможен транспорт на ПМ (секреторный, или экзоцитозный, путь ), в ранние или поздние эндосомы или лизосомы.

Аппарат Гольджи: открыт Камилло Гольджи в 1898 г. Точный механизм функционирования неизвестен. Имеет характерное строение: Несколько плоских блинообразных цистерн с утолщениями по краям, окруженных везикулами d= 50 -70 нм Хорошо известна функция : Модификация синтезированных в ЭПР белков, (гликозилирование , сиалирование etc. ) с помощью резидентных ферментов cis trans

Как синтезированные de novo белки транспортируются через аппарат Гольжди? Груз (cargo ) ферменты Trans- Cis- ERХХХ

Гипотеза 1 • Груз едет – ферменты остаются; • Перенос материала идет от cis- к trans- цистерне с помощью пузырьков Аппарат Гольджи – стабильный, предсуществующий компартмент

Но: оказалось, что аппарат Гольджи организован по-разному в разных организмах plants ERD 2 mammals

Но: некоторые водоросли способны сами синтезировать реснички, которые по размерам сравнимы с цистернами , но никак не с везикулами 1 ч 30 -50 ’ 10 -30’ 2 -10’ПМ Trans- Cis- ER

Tubular compartment ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC)Везикулы из ЭПР не сразу направляются к транс-цистерне, а сливаясь друг с другом, образуют кластеры тубул и везикул, называемых промежуточным компартментом ( EG-to-Golgi intermediate compartment , ERGIC ). На его основе возникает новая цис-цистерна

Гипотеза 2 — созревания Груз неподвижен — путешествуют резидентные белки Таким образом, сам состав мембран цистерны постепенно изменяется, или цистерна «созревает» Аппарат Гольжди высокодинамичен, постоянно формируется de novo

А на самом деле? • Оказалось, что половина везикул содержит преимущественно груз, половина — преимущественно резидентные белки Крупные белковые аггрегаты секретируются приблизительно за час Обычные белки – за 5 -15 мин Реализуются оба пути

Гипотеза непрерывного аппарата Гольджи

Rothman: model of percolating vesicles: медленное однонаправленное движение от cis – к trans — за счет созревания цистерн; быстрое случайно направленное движение за счет везикул, несущих как груз, так и резидентные белки TGN Trans- Cis- ERGIC ERХХХ ХХХGolgi

Аппарат Гольджи очень сложно организован Трехмерная компьютерная модель: Marsh, Howell The mammalian Golgi – complex debates (Nature Rev. Mol. Cell. Biol. , 2002, v. 3)

ХХХХХХконститутивн ая секреция Регулируемая секреция Ca 2+Экзоцитозный путь

Эндоцитозный путь – это путь попадания макромолекул извне внутрь клетки, противоположен экзоцитозному Главная сортирующая станция – ранние эндосомы Из них возможны различные «выходы» — Рециклирование обратно на ПМ, попадание в поздние эндосомы и затем в лизосомы ( путь лизосомной деградации ), В транс-Гольджи трансцитоз

The endocytic portals are specific and have definite spatial characteristics pinocytosis ( ~ 90 nm) clathrin-mediated endocytosis ( ~120 nm) macropinocytosis ( > 1 mkm) phagocytosis caveolin-depen dent endocytosis ( ~ 60 nm) recycling Golgi ER lysosome phagosome caveosomecaveolae early endosome late endosomefluid phase proteins peptide hormons, growth factors, metabolic receptors viruses, toxins viruses, toxins bacteria, large particles vitamins , chlesterol , toxins, viruses ? secondary lysosome

Пути поступления макромолекул в клетку Микропиноцитоз (жидкофазный эндоцитоз)– идет с низкой скоростью, конститутивный, везикулы м. б. пустыми СС inin tt Рецептор-опосредованный эндоцитоз – высокоизбирателен, клатрин-зависим, насыщаем СС inin tt Фагоцитоз – разновидность РОЭ Фагосом в клетке немного Макропиноцитоз – стимулируется при действии ростовых факторов; Побочный эффект раффления? Но: некоторые вирусы предпочитают этот путь Зависит от Src, PI 3 K p 85 Макропиносом < 10 на клетку

Кавеолы ( Caveolae) GPI-anchored proteins RTK, MAP-kinases Ras, PKC, Src, Vitamins, viruses, toxins. Кавеолин р21 -р24, холестерин олигомеризация 14 -16 мономеров образуют гомоолигомер

ER Golgi ( холестерин)C табильный пул кавеол Нестабильный пул кавеол способен к эндоцитозу Плоские эндотелиальные клетки 1 2 3 4 Реального везикулярного транспорта нет, есть что-то вроде kiss-and-run

Фагоцитоз, макропиноцитоз, кавеолин-зависимый путь осуществляются только в клетках определенного типа или в определенных обстоятельствах; РОЭ и микропиноцитоз есть свойство всех без исключения клеток

При м икропиноцитозе – более 90 % поглощенного материала рециклирует , 10% — идет на деградацию в лизосомы При РОЭ судьба поглощенных молекул (лигандов, L ) и их рецепторов ( R) различна Лиганды метаболических рецепторов ( асиалогликопротеины, LDL, трансферрин, etc. ) Пептидные гормоны и ростовые факторы (инсулин, EGF, FGF, PDGF etc) переносчики, каналы интернализуются, могут образовывать внутриклеточное «депо» и при внешнем сигнале встраиваться обратно, а могут доставляться в лизосомы ряд трансмембранных белков (гидролазы, липазы, Lgp, Lamp работают в лизосомах L деградация в лиз LR R рециклирование LR деградация в лиз LR рециклирование

Эндоцитозный путь – общая характеристика ЯДРОлизранние эндосомы периферические поздние эндосомы околоядерные Гольджи МТ 1 р. Н 6. 7 — 6. 5 5. 5 — 5. 0 6. 0 — 5. 5 < 5. 0 2 Слияние in vitro : Разрешено: EE – EE LE – LE EE(5’) – EE (15’) Запрещено: EE(5’) – LE (30’) 3 сортировка? EE L

Изменение локализации рецептора ЭФР в ходе эндоцитоза ( фиксированные клетки He. La)control 15 min 60 min 90 min

Эндоцитозный путь: Где граница между РЭ и ПЭ? Как и где груз переходит из РЭ в ПЭ? Где на эндоцитозном пути конмпарменты, а где – транспортные везикулы? Какова функция МВТ и их место на эндоцитозном пути? Каков механизм сортировки (на рециклирование или деградацию? ) Как груз попадает в лизосомы? Где происходит деградация интернализованных молекул?

РЭ ПЭ МТ+ р. Н+ лиз Я Ясеть транс-Го льджи. ECV лизгипотеза эндосомальных везикул-переносчиков (Griffiths) : РЭ и ПЭ – предсуществующие компартменты, сообщающиеся с помощью везикулярных посредников (ECV) МВТ = ECV теория созревания эндосом (Murphy) : РЭ превращаются в ПЭ за счет постепенного изменения состава мембран МВТ = ПЭ ПМ Нет доказательств существования ПЭ в таком виде

ПМ Тубулярная гипотеза ( Hopkins)

ЭФР-ПХ, 3 ч 18 о СЭФР-ФЭ 15 мин 37 о С, 3 ч 18 о СНевозможность перехода ЭФР-Р в ПЭ не препятствует его накоплению в околоядерной области в составе везикул-предшественников МВТ N

М ПМ Лиз. ПЭ РЭ

• Слияния происходят постоянно (но редко) на эндоцитозном пути, за счет укрупнения эндосом создается «избыток мембраны» , из которого формируются внутренние пузырьки МВТ • Закисление эндосом существенно не только для активации лизосомных ферментов, но и для регуляции слияний эндосом • Закисление происходит благодаря работе везикулярной протонной помпы Vo/V 1. • В мембранах эндосом присутствуют несколько типов Са 2+-каналов, р. Н-чувствительных и р. Н-нечувствительных, они регулируют локальные изменения уровня кальция, необходимого для слияний Bafilomycin A 1 (Baf. A 1) — ингибитор везикулярной протонной помпы Два нативных лиганда рецептора ЭФР : ЭФР – диссоциирует при р. Н < 5. 0 ; деградирует в лизосомах TGFalpha — диссоциирует при р. Н 6. 0, рециклирует

EGF + Baf. A 1 TGF + Baf. A 1 15 min 30 min 60 min 90 min 120 min

EGF 15 min 30 min 60 min 90 min 120 min. Всегда ли кажущееся увеличение размера связано со слияниями везикул? Размер везикул меньше в присутствии ингибитора протонной помпы > для укрупнения (т. е. слияний) нужен сниженный уровень р. Н (около 6. 5 — 6. 0) Структуры сложной формы – заякоренные, но не слившиеся везикулы Сегрегация, и слияние с лизосомами, (которых мы не видим) Деградация рецептора в гибридных эндолизосомах, сегрегация и слияния «вторичных» лизосом с ПМ Укрупнение эндосом + — слияния + — + — /+

Эндосомы претерпевают множественные слияния Регуляция слияний различна на разных этапах эндоцитоза На раннем этапе , по всей видимости, слияние обеспечивается участием везикул-посредников 1. «прямое слияние» 2. «опосредованное слияние» сегрегация Гибридная эндосома. РЭ с грузом РЭ-посредник Фрагментация до исходных размеров, возвращение во внутриклеточный пул «последников Вступление в новые циклы слияний

Последовательность возникновения эндосомальных структур EGFR – груз ( EGF-QD); EEA 1 — белок слияния, локализуется на везикулах-посредниках «структуры рядом -5 -15 мин » «сложные структуры-кластеры» , 15 -40 мин; «структуры близко» , > 40 мин

Клетки РАЕ EGFR-GFP -гр уз EEA 1 -белок заякоривания 5 min 30 min 90 min. Четко видна доменная структура укрупненных везикул, поскольку GFP-tag препятствует формированию МВТ Кластеры — видео 3 0 min

Функция везикул-посредников – предоставить все белки, необходимые для правильных слияний тех пузырьков, которые несут только груз, и лишены этой машинерии. Строго говоря, если имеется пул долгоживущих структур, выполняющих определенную функцию и обладающих специфическим составом, то такие структуры являются компартментом. В случае эндоцитоза везикулы-посредники и являются ранним эндосомальным компартментом, представленным набором везикул , обеспечивающих определенное преобразование груза ( его сортировку и упаковку направляемых на деградацию в лизосомы молекул во внутренние пузырьки ) эта гипотеза объединяет и гипотезу везикул-переносчиков, и гипотезу созревания

«Ранние эндосомы» не обязательно расположены на периферии клетки Они могут локализоваться и в околоядерной области, МВТ начинают формироваться, как только будет превышен «лимит мембраны» домена, содержащего груз, хотя локализация эндосомы и начало формирования внутренних пузырьков не коррелируют. Более того, это происходит ДО сегрегации ЕЕА 1 — и рецептор-обогащенных доменов

радиоактивность, отн. ед. 00. 1 0 10 20 номер фракцииконтроль вортманнин 15 мин 30 мин 60 мин 90 мин. Распределение интернализованного 125 I-ЭФР в градиенте 17%-ного Перколла Радиоактивность, отн. ед. Время, мин 0 0. 1 0. 2 0 30 60 90 контроль вортманнин Выход продуктов деградации 125 I- ЭФР в среду 0 мин 60 мин контроль ворт 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Фракции градиента Перколла. Вортманнин блокирует рецептор ЭФР в ранних эндосомах

Rab 5, 90 мин 02000040000 6000080000100000120000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 IODконтроль вортманнин Контроль вортманнин фракции градиента

15 мин, ЭФР + вортманнин , EGFR , ERD 2 Ранние эндосомы могут локализоваться и в околоядерной области рядом с аппаратом Гольджи

Если следить за эндоцитозом «с точки зрения груза» , то наиболее вероятной является гипотеза созревания ; МВТ и есть поздние эндосомы Поздние эндосомы возникают из ранних в результате множественных слияний на ранних стадиях эндоцитоза и формирования внутренних пузырьков на поздних стадиях. Одновременно их свойства постепенно изменяются как за счет слияния с везикулами из TGN , так и за счет рециклирования части мембран. Однако, учитывая наличие везикул-посредников, можно считать, что эндосомы с грузом – это транспортные пузырьки, идущие от одного предсуществующего (но везикулярного) компартмента к другому. Тогда именно везикулы-посредники и являются истинными эндосомами

ПЭ (МВТ)Путь лизосомной деградации “ Kiss-and-run” сегрегацияслияние Гибридная везикула Вторичная лизосомапервичная лизосома Слияние с ПМ (презентаци я антигенов) экзосомы ПМ

Recyclinginternalization. PM Sorting for lysosomal degradation ( ТК- dependent ) EE LE (М VB ) maturation Lys nucleus. Слияния эндосом очень важны для увеличения поверхности эндосом и формирования МВТ

0 мин 15 мин 60 мин 90 мин ЭФР-Р Rab 5 merge ЭФР-Р Rab 5 merge. Контроль вортманнин. Локализация ЭФР-Р и Rab 5 в клетках А

0 мин 15 мин 3 0 мин 6 0 мин 15 мин 3 0 мин 30 мин 60 мин. ЭФР-Р ЕЕА 1 merge ЭФР-Р ЕЕА 1 merge. Контроль вортманнин. Локализация ЭФР-Р и ЕЕА 1 в клетках А