Біоселективні елементи біосенсорів афінного типу Рачков О Е

Біоселективні елементи біосенсорів афінного типу Рачков О. Е. 22. 04. 2013

Classification of biosensors Electrical signal Interaction Bioselective Product Transducer membrane PC or recorder Analytes Catalytic Affinity-based (non-catalytic) Cells Antibodies Tissues Receptors Enzymes Nucleic acids Bio-mimics Optical Acoustic Calorimetric Nanomechanical Electrochemical

Хімічна афінність (lat. affinitas: спорідненість) — характеристика здатності певних речовин до хімічної взаємодії між собою. У хімічних процесах одночасно діють два протилежні фактори - ентальпійний (ΔH) і ентропійний (TΔS). Сумарний ефект цих протилежних факторів у процесах, що перебігають при постійному тиску і температурі, визначає зміна енергії Гіббса ΔG = ΔH - TΔS Характер зміни енергії Гіббса дозволяє судити про принципову можливість здійснення процесу: при ΔG < 0 процес може перебігати, при ΔG > 0 процес перебігати не може.

Біохімічна афінність трактується дещо більш широко. Йде мова не тільки про формування ковалентного звязку, але й нековалентних комплексів. К = [AB] / [A][B] = k 1 / k-1 Для антитіл низькою афінністю вважають при К = 105 М− 1, а високою афінністю при К = 1012 М− 1. У відповідності до рівняння ΔG = -RT • ln. K відповідні значення складуть -7 ккал/моль та -16 ккал/моль

Енергія зв'язку (kcal/mol) Ковалентний зв'язок C−H 99 C−C 83 S−S 62 S−Au 40 Водневий зв'язок O−H…: N 6, 9 O−H…: O 5, 0 N−H…: N 3, 1 N−H…: O 1, 9

Питання 1 Афінні взаємодії, їх кількісна оцінка

АФІННІ БІОСЕНСОРИ Молекулярне розпізнавання Фізичний перетворювач Аналітичний сигнал Специфічний аналіт

Области научного применения аффинных биосенсоров

Біоселективні Елементи (елементи молекулярного розпізнавання) Біологічні Біоміметичні • Антитіла • Молекулярно імпринтовані • Нуклеїнові кислоти • Аптамери • Рецептори • Олігопептиди полімери (MIП)

Питання 2 Які види матеріалів використовують в біоселективних елементах біосенсорів афінного типу ?

Біоселективні Елементи (елементи молекулярного розпізнавання) Біологічні Біоміметичні • Антитіла • Молекулярно імпринтовані • Нуклеїнові кислоти • Аптамери • Рецептори • Олігопептиди полімери (MIП)

light chains

Structure of the complex between the monoclonal antibody and the peptide R 9. (In collaboration with Dr. Mirielle Honterbeyrie, Unité de Repliement et Modélisation des Protéines, Institut Pasteur)

Study on orientation of immunoglobulin G on protein G layer Young Min Bae, Byung-Keun Oh, Woochang Lee, Won Hong Lee, Jeong-Woo Cho Biosensors and Bioelectronics (2004)

Використання химерної молекули SPA-(CBD)2 в г

Біоселективні Елементи (елементи молекулярного розпізнавання) Біологічні • Антитіла Біоміметичні • Молекулярно імпринтовані полімери (MIП) • Нуклеїнові кислоти • Рецептори • Аптамери • Олігопептиди

Використання біосенсорів на основі ДНК Визначення специфічних ДНК-послідовностей є важливим в богатьох галузях, включаючи медицину, охорону навколишнього середовища та аналіз продуктів харчування (виявлення Генетично Модифікованих Організмів чи патогенних бактерій і вірусів). Аналіз послідовності нуклеотидів в генах та дослідження поліморфізму генів, що має фундаментальну роль в експресному визначенні генетичних мутацій, що дозволяє діагнозування хвороби до появи симптомів захворювання. 20

DNA

Domain structure of the proteins Bcr, Abl and Bcr-Abl:

Breakpoints of the genes bcr and abl 5’ 5’ e 1 e 2 e 14 e 23 3’ 3’

Used oligonucleotides mod-Ph (bcr ex 14 -abl ex 2) 5' HS-(CH 2)6 -GCTGAAGGGCTTTTGAACTCTGCT-3' P 1 (complementary to the probe) 5'-AGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGC-3' N 2 (non-complementary) 5'- GATCTTCGTCCAGATCATCC -3'

Схема формирования двухцепочечных структур между иммобилизированным на поверхности золота mod-Ph и тремя исследуемыми олигонуклеотидами

Thermodynamic parameters of formation of internal doublestranded structures within the oligonucleotides mod-Ph, P 1 and N 2, and their intermolecular interactions Oligonucleotides ΔG (kcal/mol) ΔH (kcal/mol) ΔS (cal/mol/°K) mod-Ph -0. 93 -34. 10 -112. 38 P 1 -0. 25 -18. 90 -63. 19 N 2 -2. 73 -38. 70 -121. 87 mod-Ph and P 1 -33. 7 -191. 1 -533. 4 mod-Ph and N 2 -4. 3 - 29. 8 -86. 5

Immobilization and hybridization using thiol-modified probe Immobilization of thiol-modified oligonucleotides on a gold surface Deposition of MCH (1 -mercapto-6 -hexanol) Hybridization

Гибридизация олигонуклеотидов на сенсорной поверхности

F. Lucarelli et al. , Anal. Chim. Acta 6 0 9 ( 2 0 0 8 ) 139– 159

the nucleobases are attached to a neutral N-(2 -aminoethyl)-glycine pseudopeptide backbone Locked nucleic acids (LNA™, www. exiqon. com) are a class of nucleic acid analogues in which the ribose ring is “locked” by a methylene bridge connecting the 2’-O atom with the 4’-C atom F. Lucarelli et al. , Anal. Chim. Acta 6 0 9 ( 2 0 0 8 ) 139– 159

Історичні події в розвитку біосенсорів 1962 - Л. Кларк та К. Ліонс ввели поняття амперометричний ферментний електрод; 1967 - С. Апдайк та Г. Хікс детально описали ферментний глюкозний сенсор; 1969 - Гілболт та Монталво детально описали потенціометричний ферментний сенсор; 1970 - П. Бергвельд описав іон-чутливий польовий транзистор; 1973 - фірма Yellow Spring Instruments випустила перший комерційний глюкозний біосенсор; 1974 - Мосбах та Даніелсон ввели термін ферментний термістор; 1975 - Дівіс описав мікробіальний електрод; 1975 - Люберс та Опіц ввели термін оптрод; 1975 - Джаната ввів термін іммуносенсор; 1980 - Карас і Джаната вперше описали ферментний польовий транзистор; 1983 - Лідберг з колегами використали поверхневий плазмонний резонанс для моніторингу афінних реакцій в реальному часі; 1987 - Ватсон з колегами вперше описав кондуктометричний ферментний біосенсор; 1995 - Вульф вперше використав матричні полімери при розробці сенсорів; 2000 - Во-Дінх ввів термін наносенсор.

Intercalation Aromatic chromophores intercalate between adjacent bases, linker region interacts with the minor groove Binding partially unwinds the DNA, distorting and enlongating the helix Driving forces: Stacking interactions Electrostatic force Conditions: 1) Cationic species 2) Planar aromatic ring structure The structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy (PDB ID – 108 D)

Principle of the detection of small molecules binding DNA SPE Analyte e- I - Molecular recognition system: double stranded DNA II - The analyte produces a chemicalphysical modification of the immobilised DNA. Therefore, this causes a different availability in the guanine oxidation. 33

What can we detect? Toxic polycylic aromatic compounds 2 -Anthramine 2 -Naphthylamine Chlorpromazine Clomipramine

Principle TOPRO-3 I DNA-TOPRO 3 complex C

Біоселективні Елементи (елементи молекулярного розпізнавання) Біологічні • Антитіла Біоміметичні • Молекулярно імпринтовані полімери (MIП) • Нуклеїнові кислоти • Аптамери • Рецептори • Олігопептиди

Приклад створення афінного сенсора Основна ціль: • Розробити метод іммобілізації нюхового рецептора OR 1740 на поверхні відповідного перетворювача • Дослідити чутливість іммобілізованого OR 1740 нюхового рецептора до його специфічного – HELIONAL та неспецифічного – HEPTANAL лігандів. 37

OR 1740 was expressed in yeast S. cerevisiae Ultrasonication + Membrane nanovesicles (nanosomes): • Spherical • Size 50 -500 nm 38

Архітектура біоселективної мембрани на основі OR 1740 рецептора OR 1740 Biotinylated antibody SAM Neutravidin Biotin-PE Au, 50 nm Cr, 1 nm 16 -MHDA Glass support 39

ППР-спектрометр “Біосуплар-3” Насос Розроблено в Інституті фізики напівпровідників НАН України (Київ, Україна) Джерело світла : Ga. As напівпровідниковий лазер (670 nm) Об’єм проточної комірки: ~20 μL 40

ППР контроль формування мультишарів The best multilayers were obtained on the basis of SAM blocked with BSA molecules 41

Імпедансні дослідження взаємодії OR 1740 з молекулами одорантів HELIONAL HEPTANAL 42

Біоселективні Елементи (елементи молекулярного розпізнавання) Біологічні • Антитіла • Нуклеїнові кислоти • Рецептори Біоміметичні • Молекулярно імпринтовані полімери (MIП) • Аптамери • Олігопептиди

ВИСОКОЧУТЛИВИЙ ТА ВИСОКОСЕЛЕКТИВНИЙ АНАЛІЗ ОРГАНІЧНИХ МОЛЕКУЛ ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФІЯ З МАСС-СПЕКТРОМЕТРІЄЮ ІМУНОСЕНСОРИ Висока селективність і чутливість Надзвичайно дороге обладнання Іммобілізація Стабілізація Висока вартість ПОЛІМЕРИ-БІОМІМІКИ Висока селективність Низька вартість Термостабільність Механічна Стабільність в агресивних середовищах 44

Принцип молекулярного імпринтингу Функціональні мономери Матрична молекула самозборка полімеризація + зшиваючий агент ЕКСТРАКЦІЯ матричних молекул ЗВ’ЯЗУВАННЯ матричних молекул Селективна каверна 45

Питання 3 Молекулярно імпринтовані полімери (MIП) як складова біоселективних елементів афінного типу

Біоселективні Елементи (елементи молекулярного розпізнавання) Біологічні • Антитіла Біоміметичні • Молекулярно імпринтовані полімери (MIП) • Нуклеїнові кислоти • Рецептори • Аптамери • Олігопептиди

Aptamers are oligonucleotides (DNA or RNA molecules) that can bind with high affinity and specificity to a wide range of target molecules (proteins, peptides, drugs, vitamins and other organic or inorganic compounds). They were “discovered” in 1990 by the development of an in vitro selection and amplification technique, known as SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment). Their name is derived from the Latin word “aptus” which means “to fit” and the Greek word “meros” part or region !

Combinatorial oligonucleotide library T 7 promoter random sequence (25 bases) 5’ 3’ constant region A, G, C, U(T) 41 = 4 42 = 16 43 = 64 44 = 256 45 = 1024 …………. 425 = 1125899906842624 constant region Pool of randomized DNA or RNA 1015 different sequences!!!!

Immobilization optimization (SPR) 5’ biotinylated aptamers 5’ thiol modified thrombin aptamer 1 (15 -mer) CM 5 Biacore chip

Sandwich assay Detection limit 1. 4 n. M 0. 7 n. M (sandwich) (thrombin physiological conc. range: low n. M – low m. M)

Питання 4 Аптамери як складова біоселективних елементів афінного типу

Біоселективні Елементи (елементи молекулярного розпізнавання) Біологічні • Антитіла Біоміметичні • Молекулярно імпринтовані полімери (MIП) • Нуклеїнові кислоти • Аптамери • Рецептори • Олігопептиди

Dr. Michael Zasloff, founder of Magainin Pharmaceuticals, USA, a bio- technology company researching new types of antibiotics. Zasloff is seen holding an African clawed frog (Xenopus laevis). It is from the skin of this type of frog that Zasloff isolated the antibacterial chemical "magainin". Magainin is a small peptide that not only kills bacteria, but fungi and even tumour cells. Zasloff has also isolated the chemical squalamine, an antibacterial agent found in shark's liver. The search for new antibiotics is urgent because bacteria causing traditional human diseases are becoming resistant to all known antibiotics.

Magainin I (GIGKFLHSAGKFGKAFVGEIMKS) binds most selectively to the bacterial cell E. coli O 157∶H 7

Питання 5 Олігопептиди як складова біоселективних елементів афінного типу

Дякую за увагу!