БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ И БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Профессор УГАРОВА Наталья Николаевна

БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ И БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Профессор УГАРОВА Наталья Николаевна Кафедра химической энзимологии, Химический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова

E-mail nugarova@gmail. com Phone/FAX +7 (495) 9392660

Люцифераза светляков Luciola mingrelica

Мутагенез остатков 1 - 225 в люциферазе светляков C-домен ПЦРмутагенез N-домен 1 -191 остатки люциферазы (субдомен A)

Спектры биолюминесценции мутантных люцифераз Luciola mingrelica люцифераза «дикого типа» мутант F 16 L мутанты: Y 35 N, Y 35 H F 16 L+A 40 S

Локализация ключевых мутаций, снижающих зависимость спектра биолюминесценции от p. H C-домен F 16 Y 35 Люциферин в активном центре A 40 L. cruciata crystal structure: Nakatsu et al, 2006

ПРИМЕНЕНИЕ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ ü ультрачувствительная детекция ATФ ü детекция активности фосфатаз и других ферментов ü использование в качестве гена-репортера в молекулярной биологии и биомедицинских исследованиях ü использование в пиросеквенировании ДНК ü использование для мониторинга фолдинга белков in vivo и активности шаперонов

ЛОКАЛИЗАЦИЯ Cys-ОСТАТКОВ В ЛЮЦИФЕРАЗЕ СВЕТЛЯКОВ Luciola mingrelica ü Удалены от активного центра ü Доступны для окислителей ü Гидрофильное микроокружение 393 82 284 146 260 164 62 86

Кинетика термоинактивация WT люциферазы Luciola mingrelica и мутантных форм при 37°С Условия: 0. 05 M Tris-ацетат, 2 м. М ЭДТА, 10 м. М Mg. SO 4, p. H 7. 8, 10 -8 М фермент

Мутагенез остатков 130 -390 в люциферазе Luciola mingrelica ПЦР мутагенез --Остатки -- 130 -390 из 548

Получение термостабильных мутантов люциферазы Luciola mingrelica методом направленной эволюции Ген люциферазы Случайный мутагенез (остатки 130 -390) ПЦР пониженной точности 4 цикла мутагенеза Скрининг In vivo по термостабильности Термостабильные мутанты Библиотека мутантных генов Трансфекция в вектор для трансформации при 37 -55°C Библиотека колоний на чашках Петри

Свойства термостабильного мутанта люциферазы Luciola mingrelica 4 TS 37˚C S 118 C 50˚C 2 TM 1 1 TM 1 55˚C 3 TM 1 T 213 S K 156 R C 146 S S 364 C A 217 V E 356 K R 211 L 4 TS

Локализация мутаций в мутантной люциферазе Luciola mingrelica 4 TS

Кинетика термоинактивации люциферазы: дикого типа (WT) и мутантной (4 TS) Условия: 50 м. М Трис-ацетат, 20 м. М Mg. SO 4, 2 м. М ЭДТА, 0. 2 мг/мл БСА, p. H 7. 8, 0. 01 мг/мл люциферазы

Люциферин-люциферазная система светляков АТФ-реагент D-люциферин, Mg. SO 4, люцифераза + ATФ Продукты реакции + Свет ( max = 570 нм)

Люминометр «ЛЮМ-1» совместная разработка МГУ и ООО «ЛЮМТЕК» Ш предел обнаружения АТФ: 10 -15 моль/мл Ш вес прибора: 650 г Ш рабочий диапазон температур: от 10 С до 30 С Ш встроенная память Ш наличие интерфейса Ш программное обеспечение Ш автономное питание

АТФ - универсальный индикатор присутствия живых клеток Биологический материал Ткани млекопитающих Бактерии Одноклеточные водоросли Содержание АТФ, мкг/г сухой биомассы 500 -5000 1000 -10000 500 -5000

Корреляция между концентрацией АТФ и интенсивностью биолюминесценции (1) и количеством бактериальных клеток (2) в образце

Биолюминесцентная АТФ-метрия в медицине Ø скрининг микробных загрязнений в биологических жидкостях ( моча, кровь, раны) Ø быстрое определение чувствительности возбудителя к антибиотикам при химиотерапии инфекционных заболеваний Ø оценка действия иммуномодуляторов и митогенов (вместо радиоактивного метода)

Кинетика изменения концентрации АТФ в суспензии бактериальных клеток 1 - в отсутствие антибиотика 2 - в присутствии малоактивного антибиотика 3 - в присутствии высокоактивного антибиотика (столбиками показано содержание АТФ после 5 часов роста)

Биолюминесцентная АТФ-метрия в пищевой промышленности - Контроль микробиологической чистоты исходного сырья, полупродуктов и готовой продукции - Контроль чистоты и эффективности дезинфекции производственных помещений, оборудования и персонала

Биолюминесцентное определение бактериального загрязнения в биологическом образце бактерии соматические клетки свободный АТФ бактериальный АТФ бактерии Разрушение соматических клеток Разрушение бактерий и перевод бактериального АТФ в раствор свободный АТФ Удаление свободного АТФ и концентрирование бактерий фильтрованием бактерии Добавление АТФ-реагента Измерение биолюминесцентного сигнала

Определение класса сырого молока (КМАФАн. М) по концентрации бактериального АТФ в молоке (ГОСТ Р 52415 -2005) Длительность анализа – 35 мин (вместо 3 суток) Концентрация бактериального АТФ в молоке, пикомоль/см 3 Класс молока (КОЕ/см 3) Менее 12 Высший (до 300 тыс. ) 12 – 18 I (300 - 500 тыс. ) 18 – 109 II (500 - 4000 тыс. ) 109 – 431 III (4000 - 20000 тыс. )

Определение микробной загрязненности поверхности технологического оборудования по концентрации бактериального АТФ, Длительность анализа - 5 минут Концентрация бактериального АТФ в смыве с поверхности, пмоль/мл Тысяч КОЕ/100 см 2 поверхности 0, 01 50 0, 1 500 1 5 000 10 50 000

Биолюминесцентная АТФ-метрия в сельском хозяйстве Ø диагностика мастита коров Ø оценка кондиционности семенного материала животных при криоконсервации Ø контроль титра жизнеспособных клеток в лиофилизованных ветеринарных вакцинах

Определение содержания соматических клеток (ССК) в молоке и диагностика мастита по концентрации небактериального АТФ Длительность анализа – 2 минуты Концентрация Величина ССК в небактериального молоке, тысяч АТФ в молоке, клеток/см 3 молока 3 нмоль/см Примечание менее 0, 18 менее 100 Животное здорово 0, 18 - 1, 60 100 - 500 Подозрение на мастит более 1, 60 более 500 Животное больно маститом

Биолюминесцентная АТФ-метрия в экологии - Контроль микробных загрязнений в природных водоемах - Оценка состояния активного ила в водоочистных сооружениях - Подбор биоцидов и штаммов биодеструкторов для разрушения отходов

БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ АТФ-МЕТРИЯ И БОРЬБА С БИОТЕРРОРИЗМОМ - быстрое обнаружение бактериального или спорового инфицирования различных объектов

Обнаружение заражения образца спорами микроорганизмов + MTSB Споры + BRA Проращивание спор в вегетативные клетки АТФ-реагент свет ( max = 570 нм)

Использование люциферазы светляков для изучения белок-белковых взаимодействий (метод резонансного переноса энергии биолюминесценции)

Гены люцифераз как репортерные гены

Люциферазы как маркеры опухолевых клеток