Biología Molecular Temas: 7. 9 Hibridacion de sondas tipo Southern 7. 10 Hibridacion de sondas tipo Northern Alumno: José Ulises Montes Amparán.
l Comprender los conceptos y principios básicos de la hibridación de ácidos nucleicos. l Explicar los procedimientos de la hibridación tipo Souther para la identificación de genes y genomas, así como aplicaciones en diferentes campos y actividades humanas. l Explicar los procedimientos de la hibridación tipo Northem para analizar la expresión de genes, así como aplicaciones en diferentes campos y actividades humanas.
l Considerar que las técnicas se basan en metodologías inflexibles, siendo que éstas son adaptadas a la muestra que es analizada y a las posibilidades de quien las practica. l No comprender la naturaleza y propiedades de los ácidos nucleicos. l No comprender los fundamentos de la hibridación. molecular. l No tener clara la diferencia entre métodos de marcaje y pensar que sólo un tipo de técnica es útil para un propósito particular.
l Hibridización: Formación de dúplex a partir de cualquier combinación de ácidos nucleicos. l Estringencia: Son las condiciones a las cuales se desarrolla la hibridización y la detección del duplex. l Baja estringencia: Permite mayor cantidad de hibridación pero con menor especificidad (baja temperatura, alta concentración de sales). l Alta estringencia: Menor cantidad de hibridación pero mayor especificidad.
l Copia única: Secuencia de DNA que se encuentra una sola vez por genoma. l DNA repetido: Secuencias presentes en más de una copia. l Dúplex: Estructura de ácidos nucleicos de doble cadena. l Desnaturalización: Proceso por el cual se generan cadenas sencillas a partir de un dúplex. l Reasociación/Renaturalización: Unión de dos secuencias complementarias por medio de apareamiento de bases.
l Temperatura. l La concentración de sales. l Bases no complementarias. l Longitud del fragmento. “Es importante tomar en cuente estos factores ya que las condiciones optimas no son las mismas para cada experimento. ”
l Son oligonucleótidos sintéticos, c. DNA, fragmentos de DNA genómico o RNA de cadena sencilla complementarias a la región de DNA o RNA blanco. l Contienen alguna “marca” que revela su unión (hibridación) a la secuencia elegida, generalmente se trata de P 32.
l El método tipo Southern blot fue desarrollado por E. M. Southern en 1975 para la detección de genes específicos en el ADN celular. El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante una electroforesis en un gel. Las bandas de DNA se visualizan por tinción y se toma fotografía. El DNA del gel se fragmenta con HCl y se desnaturaliza con Na. OH. Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. .
A continuación el filtro se incuba con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas con fluorocromo
l Caracterizar la identidad de genes específicos. l Identificar fragmentos de DNA que contienen un gen determinado, entre una mezcla de muchos fragmentos. l Investigar la organización molecular de las secuencias genómicas. l Detectar reorganizaciones y duplicaciones en genes asociados a enfermedades genéticas humanas y a cáncer. l Detección de restriction site polymorphism (RSP). l Detección de mutaciones puntuales mediante RFLP
l El método, tipo northern blot, se utiliza para identificar ARN a diferencia de l metodo Southern que se utoliza para identificar ADN. l Las moléculas de RNA son separadas por electroforesis en geles desnaturalizantes. l Las bandas de RNA y marcadores de peso molecular se visualizan por tinción y se toma fotografía. l Los bandas del gel se transfieren a membranas de nylon. l La membrana se seca y se fija. l Se aplica la sonda previamente marcada. l Se permite la hibridización a diferentes condiciones de estringencia en buffer desnaturalizante.
Detecta la presencia de RNA de uno o varios tipos celulares o tejidos, complementario a la sonda.
l Proporciona información de la presencia de un transcrito de RNA complementario a la sonda. l Es posible examinar patrones de expresión génica. l Permite detectar cortes y empalmes del m. RNA y múltiples tipos de transcritos provenientes de un solo gen. l Es posible caracterizar y cuantificar transcripcional de un gen determinado. la actividad
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