БИОФИЗИКА МЕМБРАННЫХ ПРОЦЕССОВ клетка Клетка

БИОФИЗИКА МЕМБРАННЫХ ПРОЦЕССОВ клетка

Клетка - открытая система Элементарная живая система: Самостоятельное существование Развитие Размножение Автономна по отношению к окружающей среде Взаимодействует с окружающей средой

Схематическое изображение клетки животного и растения

БМ в клетке Плазматическая мембрана - образует границу клетки Органеллы • Ядро • Эндоплазматический ретикулум • Аппарат Гольджи • Лизосомы • Митохондрии • Хлоропласты • …. •

Основные функции БМ Барьерная – селективный, регулируемый пассивный транспорт, активный обмен веществом с окружающей средой Матричная – определенное взаимное расположение и ориентация мембранных белков Механическая – прочность и автономность клетки, внутриклеточных структур

Дополнительные функции БМ Энергетическая – синтез АТФ и фотосинтез Генерация и проведение потенциалов Рецепторная – механическая, акустическая, обонятельная, зрительная, химическая, терморецепция ….

Развитие представлений о строении биологических мембран XIX в – ПМ - определенная структура к XIX в – Овертон: БМ состоят из молекул, которые похожи на молекулы масла (липиды) 1925 г – Гардер и Грендел БМ образована 2 -ым слоем липидных молекул (липидный бислой) кювета Ленгмюра

Развитие представлений о строении биологических мембран 1935 г Коул и Кертис – подтвердили гипотезу БМ двойной липидный слой электрическое сопротивление 107 Ом▪м 2 удельная электрическая емкость 0, 5*10 -2 Ф/м 2 БМ – электрический конденсатор Толщина неполярной части

Развитие представлений о строении биологических мембран 1935 г Дэвинсон и Даниелли – модель БМ «сендвича» • Рентегоструктурный анализ – упорядоченность в расположении липидных молекул в БМ • Электронная микроскопия – в БМ встроены глобулярные частицы • 1972 г – Спингер и Николсон – жидко-мозаичная модель БМ: БМ текучий фосфолипидный слой, в который погружены свободно диффундирующие белки •

Развитие представлений о молекулярной организации БМ (по Ю. А. Владимирову)

Образование мембранных структур • Основные молекулярные компоненты БМ – биополимеры, функционирующие в водной среде

Методы изучения БМ (состав, структура, строение) Электронная микроскопия а) оптический микроскоп: отдельные части клетки б) электронный микроскоп внутреннее строение, клеточные органеллы, детали строения БМ «Замораживание-скол-травление» • ЭПР, ЯМР, флуоресцентные методы: динамические характеристики БМ •

ЭПР Различия в спектрах ЭПР в зависимости от способа прикрепления спиновой метки к фосфолипидной молекуле

Изменение спектров ЭПР при увеличении подвижности (уменьшении микровязкости)

БМ Функциональные структуры клетки, которые ограничивают цитоплазму и большинство внутриклеточных структур, образуют единую систему канальцев, складок и замкнутых полостей Толщина 10 нм масса 1/2 массы сухой клетки Состав: липиды, белки, углеводы

Вода в БМ 1) Связанная вода • а) внутренняя связанная вода • б) вода гитратных оболочек • в) слабосвязанная вода 2) Свободная вода 3) Захваченная вода

Физическое состояние липидных мембран Газ Жидкость Твердое тело Плазма БМ – жидкокристаллическое агрегатное состояние

Жидко - кристаллические структуры

Фазовые переходы в липидных мембранах

Модельные липидные мембраны Схема строения однослойной липосомы

Модельные липидные мембраны Образование плоской бислойной липидной мембраны

ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕМБРАН

Подвижность молекулярных компонентов в мембранах Вращательная подвижность. Время поворота липида вокруг своей оси на 1 рад 10 -9 с Латеральная диффузия - перемещение молекул липидов вдоль слоя. Коэффициент латеральной диффузии D 10 -7 - 10 -8 см 2/с Среднеквадратичное расстояние

Передвижение иона в липидном слое мембран

Подвижность молекулярных компонентов в мембранах

Подвижность молекулярных компонентов в мембранах Частота перескоков Площадь, занимаемая одной молекулой f Характерное время перескока

ЭПР Различия в спектрах ЭПР в зависимости от способа прикрепления спиновой метки к фосфолипидной молекуле (подвижность)

Трансбислойное движение: флип-флоп-переход Время движения в БМ: • -БМ электрического органа угря 3 -7 мин • -БМ эритроцитов 20 -30 мин • Модельные визикулярные мембраны 10 - 20 ч и более

Константы латеральной диффузии мембранных белков

Микровязкость углеводородной области липидного бислоя в искусственных и природных мембранах, маслах и жидкостях

Упругие свойства мембран В равновесном состоянии (T=const) Свободная энергия Гельмгольца F=U-TS (d. F)T=d. U-Td. S=d. W [F]=[W]=Дж/м 2=Н/м Деформации - относительное изменение площади: растяжение (сжатие) = S|S - Растяжение (сдвиг) поверхности

• Изотропное растяжение поверхности БМ относительно равновесного состояния, натяжение Т 0 • Модуль поверхностного изотермического сжатия (модуль Юнга) • Поверхностный модуль упругости при сдвиге

Силы, действующие на мембрану • • • Р –сжимающие f - растягивающие h – толщина мембраны

Сравнение свойств искусственных липидных и биологических мембран Свойство Биомембран БЛМ ы Электронно-микроскопический снимок поперечного среза Трехслойная структура Трехслойн ая структура Толщина, нм 6, 0 -10, 0 2, 5 -8, 0 Сопротивление, Ом*см 2 Электрическая емкость, мк. Ф/см 2 Показатель преломления 102 -105 0, 5 -1, 3 106 -109 0, 2 -1, 0 1, 6 1, 56 -1, 66 Проницаемость для воды, мкм/с 0, 5 -400 31, 7

Разрушение БМ Слияние клеток • Лизис (разрушение) • Гемолиз (разрушение эритроцитов с выделением гемоглобина) Липидные мембраны – метастабильные системы Значительные отклонения параметров БМ от равновесных, приводят к возникновению и накоплению дефектов в структуре •

Сквозная пора – критический дефект Тепловые флуктуации Электрический пробой Замораживание Действие ПАВ Осмотическое давление Др

Поры в БМ

Размер поры R<R* (КРИТИЧЕСКИЙ РАДИУС ПОРЫ) R>R* (КРИТИЧЕСКИЙ РАДИУС ПОРЫ) Пора залечивается Необратимое разрушение мембраны - гибель

Модель критической поры р h/2 2 r 0 р(h/2) – расширение поры h р(r 0) – сжатие поры

Энергия образования поры

В ЖК фазе БМ

Образование поры в ЭП– электрический пробой

В ЖК фазе БМ при электрическом пробое

Энергия поры при различных значениях мембранного потенциала

Энергия дефекта в БМ в отсутствие ЭП (1) при наложении разности потенциалов (2)

Энергия поры в жидкокристаллическом состоянии БМ (А) и гель - состоянии (Б) мембранных липидов

Размеры липидных пор в модельных и клеточных мембранах Радиус поры r, нм Объект Соотношение радиусов пор Стрессовое состояние 3, 0 -4, 0 Эритроцит rжк с >rэп>=r Электрический пробой 2, 0 То же rжк с >r Осмотический гемолиз 1, 2 L-клетки rжк с >rэп>=r Электрический пробой 0, 2 -2, 0 Липосомы rжк с >r Осмотический лизис 0, 6 -0, 8 То же rжк с >rгель>=r Фазовый переход 0, 5 -2, 0 То же rжк с >rгель>=r Фазовый переход 1, 2 -1, 8 БЛМ rжк с >rгель>r>rэп гель Фазовый переход

Зависимость изменения энергии поры от радиуса

ТРАНСПОРТ ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ Виды транспорта. Пассивный транспорт

• • • Живые системы - открытые системы на всех уровнях организации Необходимое условие существования клетки – транспорт веществ через БМ, который обеспечивает: -метаболизм клетки -биоэнергетические процессы создания потенциалов и генерации нервного импульса Нарушение транспортной функции БМ – развитие патологии

Потенциалы в клетке ХИМИЧЕСКИЙ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ

Химический потенциал

Электрохимический потенциал

Виды транспорта через БМ Пассивный транспорт перенос вещества без затраты энергии Активный транспорт перенос вещества с затратами энергии Пассивный транспорт - это транспорт самопроизвольный, без затраты энергии, "под гору". Активный - требует затраты энергии.

Пассивный транспорт через БМ осмос фильтрация Простая диффузия Облегченная диффузия С подвижным переносчиком через липидный слой через липидные поры через Белковые поры С фиксированным переносчиком

Простая диффузия: а – через липидный слой б – через липидные поры в – через белковые поры

Пассивный транспорт Перенос k-ого вещества по градиенту ЭХП, то есть из мест с большим значением ЭХП к местам с меньшим значением ЭХП С 1 м мембрана > l С 2 м С 2 jm

Плотность потока (J) – величина, равная количеству вещества, перенесенного за единицу времени через единицу площади поверхности, перпендикулярной направлению переноса [J]=1 моль/с*м 2 Уравнение Теорелла – плотность потока к-го сорта вещества при пассивном переносе

Причины пассивного транспорта Градиент концентрации Градиент ЭП

1 закон Фика С 1 м мембрана > l С 2 м С 2 jm

Нестационарная диффузия Jk S x x+dx x

Количество вещества, накапливающегося в объеме

Коэффициент диффузии Dk Зависит от размера и формы молекул Для малых молекул Для сферических молекул

Проницаемость мембран - Хорошая для: Неполярных веществ (хорошо растворимые в липидной фазе) Органические кислоты эфиры - Плохая для: Полярных (водорастворимых) веществ Соли Основания Спирты Сахара Аминокислоты

Образование кинков а – транс-конфигурация б - гош-транс-гош конфигурация

Пассивный транспорт через липидные поры Липидные поры –гидрофильные поры в липидном бислое Белковые поры

ЛИПИДНЫЕ ПОРЫ Размеры канала изменяются в зависимости от внешних условий и имеют динамических характер Размеры варьируются в широких пределах, поры могут «затекать» Нет выраженной избирательности каналов - универсальны БЕЛКОВЫЕ ПОРЫ Размер сохраняется на протяжении всей жизни поры Фиксированный набор радиусов Избирательность переноса

Пассивный транспорт: облегченная диффузия С ПОДВИЖНЫМ ПЕРЕНОСЧИКОМ С ФИКСИРОВАННЫМ ПЕРЕНОСЧИКОМ Отличия от простой диффузии: 1. Значительно быстрее 2. Имеет свойство насыщения (все молекулы переносчики - заняты) 3. Высокая специфичность 4. Вещества – блокаторы облегченной диффузии (ингибиторы)

Схема переноса валиномицином ионов калия через мембрану

Зависимость плотности потока веществ через БМ в клетку в зависимости от соотношения концентраций 1 – простая диффузия 2 – облегченная диффузия

Пассивный транспорт - осмос • Диффузия воды из мест с ее большей концентрацией в места с меньшей концентрацией Осмотическое давление Вода р1 р2

Пассивный транспорт фильтрация Движение раствора через поры под действием градиента давления

Простая диффузия (вверху), облегченная диффузия через канал в мембране (в середине) электрофорез ионов - внизу.

Насыщаемый и ненасыщаемый транспорт ионов. При обычной диффузии потоки невелики, но прямо пропорциональны концентрации иона в среде, из которой происходит перенос (нижняя прямая). При переносе через канал или с помощью подвижного переносчика потоки гораздо больше, но при увеличении концентрации ионов наступает насыщение.

Активный транспорт веществ через БМ

Активный транспорт • • • Перенос k-ого вещества против градиента ЭХП, то есть из мест с меньшим значением ЭХП к местам с большим значением ЭХП Сопровождается увеличением энергии Гиббса Не может идти самопроизвольно, а только в сопряжении с процессом гидролиза АТФ, те за счет энергии, запасенной в макроэргических связях

Схема активного транспорта k-ого вещества против градиента ЭХП, то есть из мест с меньшим значением ЭХП к местам с большим значением ЭХП Перенос k(х1) мембрана < l k (х2) jm

Функции АТ • Создание градиента концентрации вещества • Создание градиента электрического потенциала • Создание градиента давления АТ УДЕРЖИВАЕТ ОРГАНИЗМ В НЕРАВНОВЕСНОМ СОСТОЯНИИ

Опыты Уссинга: 1949 г. АТ показан на примере переноса ионов натрия через кожу лягушки

• • АТ ионов Na+ : в коже лягушки близок к переносу ионов через эпителий в кишечнике и почечных канальцах В нервных клетках локализован в плазматических мембранах АТ ионов Сa++ : В мембранах саркоплазматического ретикулума АТ ионов Н+ : В энергосберегающих мембранах митохондрий и хролопластов

Механизмы АТ Ионные - - - насосы Na+ насосы: локализованы в плазматических мембранах нервных клеток Сa++ насосы: локализованы в мембранах саркоплазматического ретикулума Н+ насосы (помпа): локализованы в энергосберегающих мембранах

Na+ насос (Na-К-АТФ-фаза)

Сa++ насос (Са-АТФ-фаза)

Н-насос (протонная помпа)

Схема механизма Na-К-АТФ-фазы

Схема механизма Na-К-АТФ-фазы • • 1. образование комплекса фермента с АТФ на внутренней поверхности мембраны 2. связывание комплексом 3 -х ионов натрия 3. фосфорилирование фермента с образованием АДФ 4. переворот (флип-флоп) фермента внутри мембраны 5. реакция ионного обмена натрия на калий на внешней поверхности мембраны 6. обратный переворот ферментного комплекса с переносом ионов калия внутрь клетки 7. возвращение фермента в исходное состояние с освобождением ионов калия и неорганического фосфата

Активный транспорт Электронейтральный Электрогенный Функционирование транспортной системы сопровождается обменом внутриклеточных ионов на внеклеточные в отношении «заряд на заряд» количество зарядов, переносимых за единицу времени в одном направлении НЕ компенсируется суммарным зарядом, переносимым в противоположном направлении Создаются дополнительные разности потенциалов

Индуцированный ионный транспорт Процессы переноса ионов через БМ, обусловленные наличием механизмов, облегчающих обмен ионами между внеклеточной средой и внутриклеточной средой

Затраты энергии, необходимые для проникновения ионов из воды в БЛМ (формула Борна):

W: Барьер для прохождения ионов щелочных металлов через гидрофобную часть липидного бислоя Крупные органические ионы проникаю легче (r W ) воды БЛМ W Перенос ионов ИОНОФОРАМИ

Ионофор, образующий комплекс • • Могут образовывать с ионом комплекс большого радиуса – переносчик «малая карусель» и «большая карусель» Формируют пору в БМ, заполненную водой – ионные каналы b k b r

Каналообразующий ионофор Внешняя часть молекулы – гидрофобна, внутренняя – гидрофильна На одном из концах молекулы – «якорь» заряженные и сильно полярные группы, которые удерживают молекулу на одной стороне мембраны и позволяет ей пронизывать гидрофобную часть БМ

Виды каналообразующих ионофоров Грамицидин А-цепь из 15 гидрофобных аминокислот спираль полый цилиндр пора низкая селективность из-за высокой эластичности спиральной структуры • Аламецитин-пептидный антибиотик – 20 аминокислот в линейной цепи водная пора переменного диаметра • • Полиеновые антибиотики

Вторичный АТ: унипорт

Вторичный АТ: антипорт

Вторичный АТ: симпорт

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОТЕНЦИАЛЫ Потенциал покоя

Биологические потенциалы • Основная функция БМ-генерация и передача биопотенциалов • Основа возбудимости клеток Регуляция внутриклеточных процессов Регуляция работы нервной системы Регуляция мышечного сокращения Регуляция рецепции • •

ЭП позволяют Электрокардиография (активность сердца) Электроэнцефалография (активность головного мозга) Электромиография (мышечная активность)

Электрические потенциалы • Окислительно-восстановительные – вследствие переноса электронов от одних молекул к другим Мембранные – возникают вследствие градиента концентрации ионов по разные стороны мембраны Мембранные потенциалы – биопотенциалы, которые в основном регистрируются в организме •

Экспериментальное исследование БП Разработка микроэлектродного метода внутриклеточного измерения БП Создание специальных усилителей БП Выбор объекта исследования – крупные клетки – АКСОН КАЛЬМАРА ( 0, 5 мм > позвоночных)

Экспериментальное исследование БП Стеклянная пипетка стеклянный электрод

Схема регистрации мембранного потенциала

Виды потенциалов Потенциал покоя Потенциал действия - разная концентрация ионов - диффузия ионов через БМ

Потенциал покоя Стационарная разность потенциалов в клетке, регистрируемая между наружной и внутренней поверхностью мембраны, находящейся в невозбужденном состоянии Обусловлен различными концентрациями ионов во внутриклеточном и наружном растворах

- разная концентрация ионов - диффузия ионов через БМ -Свн Снар -Мембрана проницаема Поток заряженных частиц через БМ Нарушение электронейтральности системы Потенциал препятствует дальнейшему перемещению ионов через БМ Равновесие ЭХП

Равновесие ЭХП формула Нернста-Планка для равновесного мембранного потенциала

Значения потенциала покоя

Формула Нернста-Планка для равновесного мембранного потенциала

Электродиффузионный транспорт через БМ Элетродиффузия – пассивный транспорт ионов через БМ 1. Отсутствуют суммарные ионные токи: Потенциал Нернста определяется концентрацией ионов в растворе 2. Ионные токи не равны 0: Пассивное движение ионов по градиенту ЭХП возникает диффузионная разность потенциалов, которая зависит от: Ионных концентраций Подвижности ионов

Способы описания процесса перехода ионов через БМ • Дискретный • Непрерывный Ионы преодолевают БМ с помощью нескольких дискретных перескоков через активационные барьеры Ионы движутся через БМ независимо и не взаимодействуя друг с другом. БМ является гомогенной фазой Описание транспорта ионов через селективные каналы клеточной мембраны Описание транспорта ионов через искусственные БЛМ

Непрерывное описание диффузии • Уравнение Нернста-Планка: 1. ЭХ равновесие 2. Отсутствие ЭХ равновесия 3. Приближение постоянного поля

ЭХ равновесие Потенциал Нернста – определение равновесной разности потенциалов на БМ – мембранный потенциал

Потенциал Нернста для одновалентных ионов 1902 г Берштейн – причина возникновения мембранного потенциала – диффузия ионов К+ из клетки во внеклеточную среду

Отсутствие ЭХ равновесия Подход Гендерсона-Планка: - Концентрация катионов и анионов в любой плоскости, перпендикулярной направлению переноса – одинаковая: С+=С-=С - В стационарном состоянии электрический ток через БМ отсутствует - Для бинарного электролита: Z+=-Z-=1

Отсутствие ЭХ равновесия

Уравнение Гендерсона U+ U—- подвижность катиона и аниона в БМ расчет диффузионного потенциала, возникающего между двумя электролитами Уравнение Гендерсона применимо: -Для мембран макроскопической толщины 1 мкм -Не применимо для липидных и клеточных мембран, где не выполняется условие локальной электронейтральности по всей толщине мембраны

Приближение постоянного поля Предположение о линейности изменения потенциала ЭП по всей толщине БМ Для тонких БМ, в которых концентрация носителей мала, а толщина двойного слоя – велика

Приближение постоянного поля Снаружи 2 1 Внутри м h x J 0 Co=KC 1 м C 2 м Ci=KC 2 м

Профиль поля - линеен

Р – коэффициент проницаемости БМ К – коэффициент растворения, который зависит от липофильности иона 1943 Гольдман + 1949 Ходжкин и Катц

Разность потенциалов, создаваемая в БМ в результате совместной диффузии ионов В равновесии

- - Потенциал на БМ определяется: Различием в стационарных концентрациях ионов по обе стороны БМ Разными коэффициентами проницаемости БМ для различных ионов

Соотношение Уссинга-Теорелла

Критерии пассивного транспорта - - - Поток ионов через БМ обусловлен: Только градиентом концентрации ионнов к-го типа Действием ЭП Нарушение соотношения Уссинга-Теорелла – существование АКТИВНОГО ТРАНСПОРТА

ПОТЕНЦИАЛ ДЕЙСТВИЯ

Потенциал действия Открыт в 18 в. Луиджи Гальвани: 1. мышечные сокращения препарированной лягушки могут вызваться электрическим импульсом 2. сама живая система является источником электрического импульса

Потенциал действия 19 в. Гельмгольц: показано, что скорость распространения нервного импульса (1 -100 м/с) значительно меньше скорости распространения электрического импульса по проводам (3*108 м/с)

Потенциал действия 20 в. А. Ходжкин: нервный импульс-импульс электрического тока 1963 г. Ходжкин, Хаксли и Иклс – Нобелевская премия по медицине «за оперирование нервных клеток»

Потенциал действия Электрический импульс, обусловленный изменением ионной проницаемости мембраны и связанный с распространением по нервам и мышцам волны возбуждения Методы: 1. Микроэлектродов с использованием высокоомных измерителей напряжения 2. Меченных атомов •

Исследование потенциала действия: схема опыта Г – генератор импульсов Р – регистратор напряжения

Регистрация потенциала действия

Потенциал действия – ПД – не зависит от амплитуды деполяризующего потенциала

Свойства ПД 1. 2. 3. 4. Наличие порогового значения деполяризующего потенциала Закон «все или ничего» Период рефрактерности Резкое снижение сопротивления БМ в момент возбуждения (покой: 0, 1 Ом*м 2, возбуждение: 0, 0025 Ом*м 2)

Положительный потенциал реверсии имеет Na природу

Проницаемость БМ В состоянии покоя: РК : РNa : РCl = 1 : 0, 04 : 0, 45 В состоянии возбуждения: РК : РNa : РCl = 1 : 20 : 0, 45

Уравнение Ходжкина-Хаксли

Эквивалентная электрическая схема элемента возбудимой мембраны

Т. Х-Х: Возбуждение элемента мембраны связано с изменением проводимости мембраны для ионов натрия и калия

Опыты с фиксацией напряжения 1. избавиться от емкостных токов 2. исключить изменение ионных проводимостей натрия и калия при изменении мембранного потенциала и изучить их изменение в различные фазы развития возбуждения

Схема исследования токов через мембрану с фиксацией мембранного потенциала 1. 2. 3. 4. 5. 6. Микроэлектрод Электрод сравнения Серебряный проводник Генератор постоянного напряжения Амперметр ОУ – операционный усилитель

Результаты исследования мембранного тока методом фиксации напряжения

Изменение проводимости БМ для ионов во время развития ПД

Распространение нервного импульса вдоль возбудимого волокна Возбудимость – способность клеток к быстрому ответу на раздражение, который проявляется через совокупность физических, физикохимических процессов и функциональных изменений. Нервная, мышечная, железистая Признак возбуждения: изменение электрического состояния клеточной мембраны: возбужденный участок клетки – электроотрицателен по отношению к невозбужденному участку

Потенциал действия - - Общее изменение разности потенциалов между клеткой и средой, происходящее при пороговом и сверхпороговом возбуждении клеток Обеспечивает проведение возбуждения по нервным волокнам Индуцирует процессы мышечного сокращения Индуцирует секрецию железистых клеток