Биофизическая химия Тема 1 Методы выделения очистки и

Биофизическая химия Тема 1 Методы выделения, очистки и анализа биопрепаратов Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации

Методы выделения, очистки и анализа биопрепаратов Методы разделяются на препаративные и аналитические. Препаративные методы применяют для получения больших объемов активных препаратов биологических соединений, которые далее используются в научных и практических целях. Аналитические методы используют малые объемы биопрепаратов для анализа чистоты, свойств, активности биологических соединений. Часто в процессе анализа биопрепарат необратимо разрушается.

Методы выделения, очистки и анализа биопрепаратов Общая схема выделения и анализа биопрепаратов

Методы выделения, очистки и анализа биопрепаратов Методы препаративного биомолекул хроматография ультрацентрифугирование электрофорез фракционирования

Методы выделения, очистки и анализа биопрепаратов Методы анализа структуры и свойств биомолекул дифракция рентгеновских лучей (рентгеноструктурный анализ) прямая информация о пространственной структуре (расположении всех атомов в пространстве). Необходимы гомогенные, хорошо очищенные, кристаллические препараты вещества Непрямые методы исследования структуры и свойств (позволяют изучать биомолекулы в растворе в условиях, когда их состояние и поведение приближено к нативному состоянию молекул в клетке) электронная микроскопия форма и размер макромолекул, упаковка субъединиц, расположение субъединиц в ассоциатах электрофорез, седиментационный анализ, хроматография чистота препарата, субъединичный состав, форма и размер макромолекул, молекулярная масса

Методы выделения, очистки и анализа биопрепаратов Методы анализа структуры и свойств биомолекул Абсорбционная спектроскопия (спектрофотометрия) вторичная структура макромолекул, ионизация отдельных групп, контроль технологических процесов Дифференциальная спектрофотометрия конформационные изменения макромолекул Инфракрасная спектроскопия (ИК-спектроскопия) вторичная структура и колебания макромолекул Круговой дихроизм (КД-спектроскопия) вторичная структура, связывание с лигандами Спектроскопия комбинационного рассеяния конформационные изменения макромолекул

Методы выделения, очистки и анализа биопрепаратов Методы анализа структуры и свойств биомолекул Флуоресцентная спектроскопия (флуоресценция) конформационные изменения макромолекул, подвижность групп и динамика структуры ЯМР (ядерный магнитный резонанс) конформация макромолекул, изменения структуры ЭПР (электронный парамагнитный резонанс) конформация макромолекул, подвижность групп

Методы выделения, очистки и анализа биопрепаратов Методы детекции и идентификации биомолекул Гибридизация нуклеиновых кислот анализ препаратов ДНК и РНК ПЦР (полимеразная цепная реакция) анализ препаратов ДНК и РНК Масс-спектрометрия анализ препаратов химических соединений Иммунохимические методы анализа детекция клеток, фрагментов клеток, белков, комплексов биомолекул Биосенсоры, биочипы детекция и идентификация молекул

Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации В клетках синтезируются 3 типа биологических (биополимеров): белки, нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), полисахариды. макромолекул Макромолекулы полисахаридов состоят из одинаковых звеньев и, поэтому, не несут информации. Они выполняют либо опорную функцию (целлюлоза в растениях), либо запасающую функцию (крахмал в растениях, гликоген у животных). гликоген

Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации Белки и нуклеиновые кислоты являются информационными молекулами, кодирование информации в которых осуществляется последовательностью различных звеньев (аминокислот в составе белков, нуклеотидов в составе ДНК и РНК), определяющей пространственную структуру макромолекулы и ее функцию. первичная структура ДНК

Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации Уровни структурной организации биологических макромолекул Условно выделяют макромолекул. несколько уровней структурной организации Первичная структура последовательность звеньев в цепи биополимера, связанных прочными ковалентными связями. Высшие уровни организации: Вторичная структура локальное упорядочивание (сворачивание) отдельных участков цепи Третичная структура пространственная укладка всей цепи Четвертичная структура пространственное расположение нескольких компактно организованных полимерных цепей

Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации Уровни структурной организации биологических макромолекул Высшие уровни организации биологических макромолекул формируются и стабилизируются (удерживаются) путем возникновения большого числа слабых нековалентных объемных взаимодействий между атомами далеко расположенных в цепи полимера звеньев. Взаимодействия, определяющие структуру биополимеров: силы Ван-дер-Ваальса; ионные (электростатические) взаимодействия; водородные связи; гидрофобные взаимодействия. Пространственная структура белков стабилизируется также формированием S-S мостиков (ковалентных дисульфидных связей между двумя остатками аминокислоты цистеин).

Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации Взаимодействия, стабилизирующие пространственную структуру биополимеров Силы Ван-дер-Ваальса ориентационное взаимодействие индукционное взаимодействие дисперсионное взаимодействие

Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации Взаимодействия, стабилизирующие пространственную структуру биополимеров Водородные связи Водородная связь осуществляется между атомом водорода, связанным с электроотрицательным атомом кислорода (О), азота (N), серы (S) в составе одной молекулы, и электроотрицательным атомом, принадлежащим другой молекуле.

Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации Взаимодействия, стабилизирующие пространственную структуру биополимеров Гидрофобные взаимодействия Определяются стремлением молекул воды сохранить структуру и максимальное число водородных связей

Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации Взаимодействия, стабилизирующие пространственную структуру биополимеров Гидрофобные взаимодействия Неполярные группы вызывают нарушение структуры водных кластеров и формирование полостей

Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации Взаимодействия, стабилизирующие пространственную структуру биополимеров Гидрофобные взаимодействия Самопроизвольность процесса определяет изменение свободной энергии Гиббса (G , G<0) G<0 G = H - T S H < H > S < S > при образовании связей, при разрыве связей, при увеличении порядка, при увеличении беспорядка Неполярные группы вызывают формирование полостей в структуре водных кластеров, что означает упорядочение, выключение из хаотического движения значительного числа молекул воды, т. е. уменьшение энтропии растворителя ( S < ) и разрыв водородных связей ( H > ). Свободная энергия системы возрастает (G , G>0), что термодинамически невыгодно и вызывает сворачивание полимера для уменьшения площади контакта неполярных групп с водой.

Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации Взаимодействия, стабилизирующие пространственную структуру биополимеров Дисульфидные связи (S-S мостики)

Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации Конформация биологических макромолекул Конформация макромолекулы это способ укладки полимерной цепи за счет образования большого количества слабых связей, в результате чего создается наиболее выгодная и стабильная пространственная структура макромолекулы. Нативная конформация это пространственная структура активной макромолекулы в клетке. Сворачивание макромолекулы в нативную конформацию фолдинг. Денатурация нарушение нативной пространственной структуры макромолекулы под действием различных факторов (температуры, р. Н среды, органических и неорганических соединений и т. д. ). Восстановление нативной пространственной денатурации ренатурация или рефолдинг. структуры после

Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации Уровни структурной организации белков

Вторичная структура белка - спираль -слой

Третичная структура белка

Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации Конформации ДНК

Биологические макромолекулы, особенности структурно-функциональной организации Ионогенные группы биологических макромолекул COOH NH 3+ OH SH His. H+ в составе белков Состояние и заряд ионогенных групп макромолекул можно регулировать, меняя состав и р. Н среды. Это позволяет регулировать суммарный заряд макромолекул, контролировать процессы денатурации и ренатурации и используется при оптимизации технологий выделения и очистки биомолекул.