Биофармацевтика занятие 4 Цитокины интерфероны интерлейкины фактор

Биофармацевтика, занятие 4 Цитокины – интерфероны, интерлейкины, фактор некроза опухолей Иван И. Воробьев, к. х. н. ptichman@gmail. com МГУ, ФФМ 09. 04. 13

Молекулярная биология цитокинов • Цитокины – регуляторные белки и гликопротеины, вырабатываемые преимущественно клетками иммунной системы в небольших количествах • Цитокины воздействуют на клетки, связываясь с рецепторами на поверхности клеток и инициируя внутриклеточные молекулярные каскады • Цитокины преимущественно действуют аутокринно и паракринно • Цитокины – “гормоны” лейкоцитов

Структурные классы цитокинов Структурный класс Примеры Структурный мотив Бета-трилистник FGF-X, IL-1 Три бета-слоя Хемокины CXCL 8 (IL-8), CCL 3, CCL 4, CCL 5 (RANTES) Две соседние S-S связи Цистеиновый узел NGF, TGF-X, PDGF Три дисульфидных связи, одна из которых пропущена через петлю, образованную двумя другими Семейство эпидермального фактора роста (EGF) EGF, TGF-α Два коротких бета-слоя и три дисульфидные связи Гематопоэтины IL-2 – IL-7, IL-9, IL-13, G-CSF, GM-CSF, LIF Пучок из 4 -х альфа-спиралей Семейство TNF-α, LT-β, TRAIL Тримерные белки

Бета-трилистник

Структура хемокинов

Цистеиновый узел Циклотид –не цитокин

Структура EGF

Гематопоэтины (четырехспиральные цитокины)

Структура TNF

Взаимодействие цитокинов с рецепторами • Комплексы цитокинов с рецепторами имеют различную стехиометрию – 1: 1, 1: 2, 3: 3 • Комплекс цитокина и рецептора обычно интернализуется, цитокин разлагается в лизосомах • Возможно взаимодействие одного цитокина с разными рецепторами • Рецепторы цитокинов могут содержать несколько субъединиц

Плейотропность цитокинов

Классификация рецепторов цитокинов Название суперсемейства рецепторов Основные лиганды Рецепторы гематопоэтических цитокинов (тип I) IL-2 – IL-7, IL-9, IL-12, G-CSF, GMCSF, EPO, LIF, CNTF, GH Рецепторы интерферонов (тип II) IFN-α, -β, -γ, IL-10 Иммуноглобулин-подобные рецепторы IL-1, IL-6, FGF, PDGF, M-CSF Тирозин-киназные рецепторы EGF Рецептор NGF, TGF 7 -ТМ рецепторы хемокины Рецепторы белка контроля комплемента Альфа-цепь рецептора IL-2

Внутриклеточный каскад передачи сигнала - киназы Tyr - Тирозин Ser - Серин АТФ - аденозинтрифосфат

Ответ клетки на стимуляцию цитокинами – транскрипционные факторы Механизм действия NFk. B

Семейство интерферонов • Индукция защиты клеток от вирусной инфекции; • Регуляция большинства аспектов иммунного ответа; • Регуляция роста и дифференцировки различных типов клеток;

Семейство интерферонов Тип интерферона Синонимы Число активных генов Секретирующие клетки IFN-α Лейкоцитарный интерферон, Bклеточный интерферон, лимфобластный интерферон >15 Лимфоциты Моноциты Макрофаги IFN-β Фибробластный 1 интерферон, IFN-β 1 Фибробласты Эпителиальные клетки IFN-γ Иммунный интерферон, Тклеточный интерферон Т-лимфоциты НК-клетки 1

Рецепторы интерферонов • Рецептор IFN-α и IFN-β (α/β-рецептор) есть у большинства типов клеток • Рецептор IFN-γ – гомодимер, взаимодействует с трансмембранным белком AF-1 Клетки, экспрессирующие рецептор IFN-γ Клетки крови Т-лимфоциты B-лимфоциты Макрофаги Гранулоциты Тромбоциты Соматические клетки Эндотелий Эпителий Клетки опухолей

Путь передачи сигнала JAK-STAT лиганд рецептор мембрана JAK STAT Ассоциация и фосфорилирование STAT Диссоциация и димеризация активированных STAT Транслокация активированного STAT в ядро Димеризация рецептора, фосфорилирование JAK ISRE, GAS ядро

Различия в биологической функции интерферонов I и II типа • Интерфероны типа I в основном ограничены антивирусной функцией и антипролиферативным воздействием на отдельные типы клеток • IFN-γ обладает очень слабой антивирусной активностью, но активирует большинство типов клеток иммунной системы

Механизм антивирусной активности интерферонов 2’-5’ олигоаденилат синтетаза

Механизм антивирусной активности интерферонов Фактор инициации трансляции 2 -альфа

ЛС Фармацевтические субстанции интерферонов Производитель Показания Intron A (r. IFN-α-2 b) Schering Plough Раковые опухоли, генитальные кондиломы, гепатит Peg. Intron A (PEGylated r. IFN-α-2 b) Schering Plough Хронический гепатит С Viraferon (r. IFN-α-2 b) Schering Plough Хронический гепатит B и C Viraferon. Peg (PEGylated r. IFN-α-2 b) Schering Plough Хронический гепатит С Roferon A (rh. IFN-α-2 a) Hoffman-La-Roche Волосатоклеточный лейкоз Actimmune (rh. IFN-γ-1 b) Genentech Хронический гранулематоз Betaferon (r. IFN-β-1 b, Cys 17 ->Ser) Schering AG Рассеянный склероз Betaseron (r. IFN-β-1 b, Cys 17 ->Ser) Berlex Laboratories and Chiron Ремиттирующий-рецидивирующий рассеянный склероз Avonex (rh. IFN-β-1 a) Biogen Рецидивирующий рассеянный склероз Infergen (r. IFN-α, synthetic type I interferon) Amgen, Yamanouchi Europe Хронический гепатит С Rebif (rh. IFN-β-1 a) Ares Serono Ремиттирующий-рецидивирующий рассеянный склероз Rebetron (combination of ribavirin and rh. IFN-α-2 b) Schering Plough Хронический гепатит С Alfatronol (rh. IFN-α-2 b) Schering Plough Гепатит B и C, онкология Virtron (rh. IFN-α-2 b) Schering Plough Гепатит B и C Pegasys (Peginterferon α-2 a) Hoffman-La-Roche Гепатит C

Метод получения ИФН-альфа в клетках E. coli • Первый препарат рекомбинантного интерферона – Intron A (IFN-α 2 b) был одобрен в 1986 г. • Белок накапливается в цитоплазме бактерий в растворимой форме, ферментер объемом 42 тыс. литров • Многостадийная хроматографическая очистка с использованием холодильных камер, кристаллизация • Лекарственные формы с добавлением альбумина

Метод получения ИФН-бета в клетках E. coli • Непарный остаток цистеина Cys 17 заменен на остаток серина • Накопление в форме телец включения, негликозилирован • Солюбилизация с детергентом ДСН, экстракция бутанолом • Формирование дисульфидных связей окислением иодозобензойной кислотой • Три стадии гель-фильтрации • Лиофилизат с добавлением альбумина

Метод получения ИФН-бета в клетках CHO (Avonex, Rebif) • Суспензионное культивирование с понижением температуры для предотвращения агрегации продукта • Многостадийная хроматографическая очистка, для Rebif –афинная, ионообменная, гельфильтрация, обращеннофазовая • Вирус-инактивация нанофильтрацией • Лекарственные формы – предзаполненные шприцы, вспомогательные вещества – альбумин, маннитол, ацетат натрия • Tmax=16 ч, t 1/2=70 ч

Конъюгаты ИФН-альфа и полиэтиленгликоля • Peg. Intron A, Viraferon. Peg – ПЭГ 12 к. Да, линейный, t 1/2=40 ч, Сmax=15 -44 ч • Pegasys – ПЭГ 40 к. Да, разветвленная цепь, Nгидроксисукцинимидный эфир м. ПЭГ, t 1/2=50 -140 ч, Сmax=72 -96 ч

Синтез Peg. Intron

Семейство интерлейкинов– принципы межклеточного взаимодействия • Не менее 33 интерлейкинов, большинство гликозилированы, от 15 до 30 к. Да. • Секретируются клетками разных типов, типичный ответ клетки на увеличение уровня одного интерлейкина – синтез другого интерлейкина • Основные биологические функции – контроль пролиферации клеток, иммунного ответа и воспалительных реакций

Про- и анти- воспалительные факторы

Факторы дифференцировки

Фармацевтически значимые интерлейкины – ИЛ-2 • Синоним – фактор роста T-лимфоцитов, вырабатывается только T-лимфоцитами при их активации, аутокринное действие • 133 ак, О-гликозилирован, рецептор из трех субъединиц • Рекомбинантный ИЛ-2 (альдеслейкин) – тельца включения E. coli, делеция Ala 1, замена Cys 125 ->Ser • Солюбилизация ДСН, восстановление, гель-фильтрация, окисление, обращеннофазовая хроматография, преципитация, растворение с ДСН • Готовая форма – лиофилизат с ДСН, маннитолом, фосфатом натрия • Показания – рак почки с метастазами

Антагонист рецептора ИЛ-1 • Гомолог ИЛ-1, образует непродуктивный комплекс с рецептором ИЛ-1. Антивоспалительный цитокин. • Рекомбинантный ИЛ-1 ра (Анакинра) продуцируется в цитоплазме E. coli в растворимой форме, содержит дополнительный остаток Met[1]. Лекарственная форма – предзаполненные шприцы по 100 мг в 0, 67 мл, содержит цитрат натрия, хлорид натрия, ЭДТА, Твин-80. • Показания – ревматоидный артрит. t 1/2=4 -6 ч.

ИЛ-11 • Продуцируется стромальными клетками ККМ и фибробластами при стимуляции ИЛ-1. Стимулирует тромбопоэз и дифференцировку предшественников макрофагов. • 23 к. Да, 178 ак, мономерный рецептор. • Рекомбинантный ИЛ-11 (опрельвекин) получают в E. coli в растворимой форме в цитоплазме в виде слитного белка с тиоредоксином и 6 x. His кластером • Очистка методами металлохелатной, ионообменной и гидрофобной хроматографии, расщепление слитного белка гидроксиламином. • Готовая форма – лиофилизат • Показания – профилактика тяжелой тромбоцитопении, вызванной курсами химиотерапии

ИЛ-11 Asn- Gly промотор Тиоредоксин I T 7 lac • • • 6 x. His Интерлейкин-11 Штамм E. coli – BL 21(DE 3) Стабильность – 6 пассажей Схема ферментации – 4 ч роста, 4 ч индукции Плотность культуры – 18 ОЕ Выход продукта – 250 мг/л Доля растворимого продукта – 75% Stop терминатор T 7

Расщепление гибридного белка

Фактор некроза опухолей – иммунный ответ В низких концентрациях TNF-α: • Активирует фагоцитирующие клетки, в том числе макрофаги и нейтрофилы • Усиливает токсическое действие эозинофилов и макрофагов на патогены • Проявляет противовирусную активность, сходную с интерферонами класса I, увеличивает экспрессию MHC I • Усиливает пролиферацию IL-2 – зависимых Tлимфоцитов

Фактор некроза опухолей – острое воспаление В высоких концентрациях TNF-α: • Активирует все про-воспалительные лейкоциты • Индуцирует экспрессию молекул клеточной адгезии на поверхности клеток сосудистого эндотелия, привлекая к очагу воспаления нейтрофилы, моноциты и лимфоциты • Обеспечивает прямой хемотаксис для моноцитов и нейтрофилов • Усиливает проницаемость сосудистой стенки путем реорганизации цитоскелета клеток эндотелия • Индуцирует синтез липидных медиаторов острого воспаления, включая простагландины и фактор активации тромбоцитов в макрофагах • Индуцирует синтез про-воспалительных цитокинов IL-1, IL 8

Фактор некроза опухолей как лекарственное средство • Beromun (ИНН tasonermin), не зарегистрирован в США • Единственное показание – саркома мягких тканей при угрозе ампутации в комбинации с мелфаланом • Способ применения – перфузия изолированной конечности дозой 3 -4 мг в течение 90 мин, вызывает некроз опухоли, t 1/2=20 -30 мин • Частично попадает в системную циркуляцию, вызывает тошноту, аритмию, поражение печени

Рецепторы ФНО

Растворимый рецептор ФНО этанерсепт 25 мг п/к 2 раза в неделю

Следующее занятие 5 Гемопоэтические факторы роста – Г-КСФ, ГМ -КСФ, эритропоэтины, тромбопоэтин • Система кроветворения, лейкопения, нейтропения и тромбопения при химиотерапии, эритропения при хронической почечной недостаточности • Колониестимулирующие факторы – Г-КСФ, М-КСФ, ГМ-КСФ, конъюгаты Г-КСФ с полиэтиленгликолем • Эритропоэтин – регуляция биосинтеза, взаимодействие с рецептором и внутриклеточная передача сигнала, методы получения линий-продуцентов рекомбинантного эритропоэтина, взаимосвязь структуры гликанов и фармакокинетики, дарбэпоэтин альфа • Тромбопоэтин – границы клинической применимости