Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY Особенности применения гелевой технологии для проведения иммуногематологических исследований в соответствии с приказом 183 н специалист по продукции Био-Рад Андрей Бордашов
Регуляторная база • Доноры ПОСТАНОВЛЕНИЕ ПРАВИТЕЛЬСТВА РФ от 31. 12. 10 № 1230 «ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ПРАВИЛ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЙ И ПРАВИЛ ОТБОРА ОБРАЗЦОВ ДОНОРСКОЙ КРОВИ, . . . » • Реципиенты Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации (Минздрав России) от 2 апреля 2013 г. N 183 н "Об утверждении правил клинического использования донорской крови и (или) ее компонентов" Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Приказ № 183 н Проведение клинического использования донорской крови. . Документальное оформление клинического использования донорской крови. . Контроль клинического использования донорской крови. . Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Пользователи приказа Все организации, осуществляющие клиническое использование донорской крови и (или) ее компонентов в соответствии ФЗ 20. 07. 12 N 125 -ФЗ "О донорстве крови и ее компонентов" В том числе СПК, если они осуществляют исследования реципиентов, индивидуальный подбор. Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Трансфузиологическая комиссия Состав: • заведующие клиническими подразделениями, • заведующие трансфузиологическим отделением • врачи, ответственные за организацию трансфузии Комментарии (transfusion. ru) Предписано создать трансфузиологическую комиссию. При неформальной работе – это эффективный инструмент повышения качества работы службы крови клиники Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Функции трансфузиологической комиссии Цикл управление процессом Планируй Переливай - организация, планирование и контроль повышения уровня профессиональной подготовки кадров по вопросам гемотрансфузии Улучшай - - разработка оптимальных программ трансфузии (переливания) донорской крови и (или) ее компонентов и разработка мероприятий по их профилактике сложных случаев Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY Проверяй - анализ результатов клинического использования донорской крови и (или) ее компонентов; анализ случаев реакций и осложнений, - контроль за организацией трансфузии (переливания) донорской крови и (или) ее компонентов в организации
Порядок иммуногематологических исследований реципиента 1) п. 7 АВО, Rh при поступлении, нуждающегося в трансфузии Врач клинического отд. обученный по вопросам трансфузиологии, [как правило на плоскости] 2) п. 8 Подтверждающее исследование проводят в КДЛ В практической жизни главные врачи, исходя из многих обстоятельств, определяют место подтверждающего определения группы крови больных в отделении • ABO, крови переливания. Rh ЛПУ, экспресс-лаборатории, клинико-биохимической лаборатории и др. Поэтому строго “привязывать” эту работу к клинико • Фенотипирование С, c, E, e, K, k, Cw диагностической лаборатории нецелесообразно. Главные врачи сами должны • Скрининг антител определиться с местом проведения подтверждающего исследования групп крови реципиентов. Как подтверждаем АВО, Rh? Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Порядок иммуногематологических исследований реципиента АВО 22. У взрослых реципиентов проводятся следующие исследования: а) первичное и подтверждающее определение группы крови по системе ABO и резус- принадлежности (антиген D) (осуществляется с использованием реагентов, содержащих анти-A-, анти-B- и анти-D-антитела соответственно); Ни слова об обратной реакции!!! б) при получении результатов, вызывающих сомнения (слабовыраженные реакции) при подтверждающем исследовании, определение группы крови по системе ABO осуществляется с использованием реагентов, содержащих анти-A- и анти-B-антитела, и стандартных эритроцитов O(I), A(II), B(III), за исключением случаев, предусмотренных подпунктом "а" пункта 68 настоящих Правил, а определение резус-принадлежности (антиген D) - с использованием реагентов, содержащих анти-D-антитела другой серии; Что означает фраза «подтверждающее исследование» ? ? ? Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Порядок иммуногематологических исследований реципиента АВО Подтверждать - заверять истинность какого-либо высказывания собственным авторитетом Подтверждать - удостоверять, свидетельствовать в истине чего, заверить Confirm - proof which shows that something is true or correct Не перепроверяем врача клинического отделения, но выносим окончательное заключение о группе крови системы АВО Возникают некоторые вопросы: 1. Зачем нужно первичное определение группы крови? 2. Что такого в повторении первичного исследования в качестве подтверждающего? Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Порядок иммуногематологических исследований реципиента АВО 1. Зачем нужно первичное определение группы крови? Уменьшение вероятности появления ошибки на преаналитическом этапе (перепутали пробирки, направления и тд. ) 2. Что такого в повторении первичного исследования в качестве подтверждающего? Был проведен анализ частоты и причин ошибок при первичном определении группы крови по системе АВ 0 (Пути повышения иммунологической безопасности гемотрансфузионной терапии в многопрофильном стационаре. А. В. Колосков «Гематология и трансфузиология» . - 2006. – т. 51. - № 3. – с. 42 – 47) 7 -8% неверных определений групп крови АВО в год Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Порядок иммуногематологических исследований реципиента АВО Источники ошибок описаны в «МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГРУПП КРОВИ АВО» (1999) По неспецифической агглютинации - «Некоторые особенности выявления неспецифической агглютинации при типировании крови по системе АВ 0» , 2007 г. , Е. П. Понамарева, Н. М. Портнова При подтверждающем определении группы крови обязательным является двойная (перекрестная) реакция, так как в задачу лаборатории входит не только подтверждающее исследование группы крови, но и выявление неспецифических свойств сыворотки (плазмы) и эритроцитов реципиента (к. м. н. Скудицкий transfusion. ru) Наиболее безопасным является подтверждение группы крови прямым и обратным методом Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Порядок иммуногематологических исследований реципиента АВО у детей п. 68 а. определение группы крови по системе ABO проводится с использованием реагентов, содержащих антитела анти-A и анти-B. У детей старше 4 месяцев группа крови определяется, в том числе перекрестным методом, с использованием реагентов анти-A, анти-B и стандартных O(I), A(II) и B(III); Как определять у детей до 4 месяцев? Антигены не сформированы до конца Для подтверждения используют реагент анти-АВ Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Порядок иммуногематологических исследований реципиента Подтверждающее определение резус-принадлежности производится в КДЛ(п. 8) п. 22 а Первичное и подтверждающее исследование резус-принадлежности (антиген-D) осуществляется с использованием реагентов, содержащих анти-D антитела п. 22 б При получении результатов, вызывающих сомнения (слабовыраженные реакции) при подтверждающем исследовании определение резус-принадлежности (антиген D) осуществляется с использованием реагентов, содержащих анти-D-антитела другой серии Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Что такое антиген D (D слабый и D вариантный) Схематичное изображение Rh D - Мутации в D-вариантном - Мутации в D-слабом Clin. Lab. 2002; 48: 53 -59 Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Схема D-нормальны, D-слабый, D-вариантный Нормально выраженный антиген D Эпитопы Присутствуют все Эпитоп: Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY D слабый Количество снижено Антиген D вариантный Структура изменена
Исследование антигена D: типы моноклональных реагентов Типы реагентов D VI - Полный антиген D D VI + +3/+4 +2/ более слабая реакция D - Вариантный -- +2 D - отрицательный -- -- D-Слабый Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Реагенты анти-D - Поликлональные (например карты ID anti-D) улавливают все варианты D - Моноклональные – могут иметь D VI+ или DVI- специфичность - Подтверждение в НАГТ (например реагент ID Diaclone anti-D) улавливает все D, но с большей чувствительностью чем поликлональные реагенты Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Как выдавать D слабый или D вариантный (D+ или D- )? В службе крови (согласно постановлению 1230, п. 5 б) определение слабых вариантов антигена D является обязательным (доноры, имеющие слабый или частичный антиген D считаются Резус (D)-положительными); Образец пациента D VI+ Определяете Rh. D реагентом, улавливающим в том числе и DVI+ Результат D+ Переливание D+ донорской крови Иммунизация Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Как выдавать D слабый или D вариантный (D+ или D- )? Требования к проведению иммуногематологических исследований доноров и реципиентов на СПК и в ЛПУ (методические указания № 2001/109) В 2. 2. 2. Тест на наличие слабых антигенов или вариантов антигена D для реципиентов не проводят. Из РЕШЕНИЯ совещания "Совершенствование лабораторной диагностики в службе крови» Москва, 20 -21 мая 2004 г При наличии слабых вариантов антигена D, резус-принадлежность реципиента считается отрицательной Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Порядок иммуногематологических исследований реципиента При определение резус-принадлежности моноклональными реагентами – используем DVI- реагенты Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Порядок иммуногематологических исследований реципиента Фенотипирование 22 в) определение антигенов эритроцитов C, c, E, e, Cw , K и k с использованием реагентов, содержащих соответствующие антитела, у: 1. детей до 18 лет, 2. женщин детородного возраста и беременных, 3. реципиентов с отягощенным трансфузионным анамнезом, имеющих антитела к антигенам эритноцитов, 4. реципиентов, нуждающихся в многократных (в том числе повторных) трансфузиях (переливаниях) донорской крови и (или) ее компонентов (кардиохирургия, трансплантология, ортопедия, онкология, онкогематология, травматология, гематология); Мужчины без тарансфузий, без аллоантител, не нуждающиеся в многократных переливаниях Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Порядок иммуногематологических исследований реципиента Сw k (cellano) Гены, кодирующие антиген Кell и cellano – относятся к одному аллелю. Варианты генотипов: КК, Кк, кк Соответственно, отсутствие cellano может быть у K положительных реципиентов Встречаемость у европеоидов К – 9%, к – 99, 8% Группы крови человека, Донсков, Мороков, 2011 Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Порядок иммуногематологических исследований реципиента Скрининг антител >3 образцов эритроцитов, - С, с, Е, е, Cw, К, k, Fya, Fyb, Lua, Lub, Jka и Jkb (пп. 7, 22, 67) (п. 22 г) В отличие от мировых производителей в нем нет антигенов M, N, S, s, P 1, Lea, Leb (transfusion. ru) Метод? Непрямой антиглобулиновый тест, детям (п. 68 г) Для взрослых - нет указаний Однако следует учитывать чувствительность и специфичность метода Почему? Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Порядок иммуногематологических исследований реципиента Присутствуют аллоантитела Лаборатория не обнаружила АТ Совместимость - НЕТ Лаборатория обнаружила АТ Совместимость - ДА Индивидуальный подбор Совместимость - ДА Переливание не проводится Безопасное переливание Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY Возможно ПТО
Порядок иммуногематологических исследований реципиента 3. Обследование в день трансфузии (контрольная проверка) Врач, проводящий трансфузию • • АВО донора и пациента Проба на совместимость (п. 25) (на плоскости при Ткомн. + Непрямой антиглобулиновый тест или Желатин или Полиглюкин) [ Требование данного пункта (непрямая реакция Кумбса или ее аналоги, реакция конглютинации с 10% желатином или реакция конглютинации с 33% полиглюкином) противоречит пункту 12 раздела III, где в качестве пробы на индивидуальную совместимость указана только проба на плоскости при комнатной температуре. ] 1. Учитывая то, что непрямой АГТ в пробирке длится более 2 часов и достаточно трудоемок – можно предсказать редкость его использования 2. Желатин и полиглюкин обладают низкой чувствительностью (обсуждение ниже) 3. Согласно п. 12 можно вообще не проводить совместимость этими методами Вывод: если лаборатория не обнаружила аллоантитела, - резко повышается вероятность ПТО. Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Порядок иммуногематологических исследований реципиента Индивидуальный подбор п. 9 Реципиентам, имеющим в анамнезе посттрансфузионные осложнения, беременность, рождение детей с гемолитической болезнью новорожденного, а также реципиентам, имеющим аллоиммунные антитела, производят индивидуальный подбор компонентов крови в клиникодиагностической лаборатории. Для проведения подбора более целенаправленно п. 23 При выявлении у реципиента антиэритроцитарных антител осуществляется: а) типирование эритроцитов по антигенам систем резус, Келл и других систем с помощью антител соответствующей специфичности; [Fya, Fyb, Lua, Lub, Jka и Jkb ] б) идентификация антиэритроцитарных антител с панелью типированных эритроцитов, содержащей не менее 10 образцов клеток; Метод проведения ИП в) индивидуальный подбор доноров крови и эритроцитов с проведением непрямого антиглобулинового теста (АГТ) или его модификации с аналогичной чувствительностью!!! Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Методы Скрининга антител, подбора донорской крови и постановки пробы на совместимость - На плоскости - С желатином - С полиглюкином - Непрямой антиглобулиновый тест (АГТ) в пробирке - Непрямой антиглобулиновый тест в геле Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Эффективность различных методов исследования для обнаружения антител к антигенам эритроцитов МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ № 99/181 от 17 мая 2000 г Под рук. д. б. н. Минеевой Н. В. Причина отсроченных ПТО Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Методы Среди методов, не требующих специального доп. оборудования (плоскость, полиглюкин, желатин и АГТ в пробирке) АГТ в пробирке является самым чувствительным (Е. Д. Чумакова, В. И. Левин, Л. С. Луц, «Медицинские новости» 2008) Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Принцип АГТ Добавление Анти. Глобулинового Реагента 14 nm 35 nm 24 nm Bio-Rad Laboratories Агглютинация IMMUNOHEMATOLOGY
Критическая стадия АГТ в пробирке – отмывка эритроцитов Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Некорректная процедура отмывки Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
НЕТ АГГЛЮТИНАЦИИ. Ложно-отрицательный результат Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Гелевая технология Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Принцип гелевой технологии Агглютинация + гель-фильтрация Центрифугирование Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Принцип гелевой технологии Способность гелевой технологии отделять эритроциты от окружающей их жидкой фазы позволяет проводить антиглобулиновый тест без процедуры промывки Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
АГТ в геле, «Принцип отсутствия промывки» промывки Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
1 - Добавление эритроцитов Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
2 - Добавление сыворотки/плазмы Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
3 - Инкубация (реакция Аг - Ат) Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Центрифугирование (1 -я мин. ) Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Центрифугирование (1. 5 мин. ) Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Центрифугирование (5 -я мин. ) Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Центрифугирование закончено (результат) Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Реакция на совместимость методом АГТ в пробирке АГТ в геле Низко авидные иммуноглобулины связанные с эритроцитами могут эллюироваться в ходе промывки Нет промывки Чрезмерное ресуспендирование может разрушить агглютинацию на стадии «формирования мостиков» при слабо положительной реакции (Holburn A. M. Quality Control. Methods in Hematology /ed. I. Cavill. — Edinburg: Нет ресуспендирования Взаимодействие антиглобулинового реагента с необезжиренной поверхностью пробирки (Voak D. , Downie D. , Moore B. et al. //Biotests Bull. — 1986. Одноразовая расходка Слабое закисление буфера (р. H < 7. 2) может увеличить эллюацию антител во время процедуры отмывки. Особенно важно в случае использования моноклонального АЧГ, когда границы оптимального р. Н – очень узкие Готовые реагенты Время постановки – более 60 мин 25 мин (Khan S. // CMAJ. — 2006. — Vol. 175, N 8. — P. 919. ) Churchill Livingstone, 1982. — Vol. 4. — P. 34— 50. ) — Vol. 1. — P. 41— 52. ) Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Решения Био-Рад Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Решения Био-Рад АВ 0 (перекрестный метод), D не включая DVI 1. Определение группы крови по АВО прямой и обратной реакцией + определение Rh принадлежности без учета D вариантного ID-карта Diaclon ABO/D + Reverse grouping ID-Dia. Cell A 1, B + Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Решения Био-Рад Определение подгруппы A ID-карта Anti-A 1 Absorbed Кат. Номер 001811 Сроки годности !!! Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY П. 40 а При выявлении у реципиента экстраагглютининов анти- 1 A ему переливаются эритроцитсодержащие компоненты, не содержащие антигена 1 A , реципиенту 2 1 A (II) переливаются эритроцитсодержащие компоненты 2 A (II) или O(I), реципиенту 2 α 1 A B (IV) эритроцитсодержащие компоненты B(III);
Решения Био-Рад Е. 1. Определение группы и резус-принадлежности крови плода и новорожденного Особенности: 1. Слабая выраженность антигенов Необходимость использования методов с максимальной чувствительностью и специфичностью 2. Отсутствие экстраагглютининов (альфа и бета) Использовать для подтверждения реагенты АВ (НЕ определяют обратной реакцией) 3. Возможная химерность при получении образца из пуповинной крови 4. Малый объем образца Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY Использование гелевого метода Использование методов работающих с малыми объемами образцов
Решения Био-Рад Определение АВО у новорожденных Dia. Clon ABO/Rh for Patients 001044 Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY ID- Dia. Clon ABO/D 001324
Решения Био-Рад ID-карта Dia. Clon Rh. Subgroups+ K Фенотипирование С, с, Е, е, К, Cw, k ID-карта Anti-k Кат. Номер 007251 Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY ID-карта Anti-Cw Кат. Номер 001311
Решения Био-Рад ID-карта Liss/Coombs или Coombs Anti-Ig. G ID-Dia. Cell I, III + Скрининг антител Стандартные эритроциты содержат на мембране все известные клиническизначимые антигены Идентификация ID-Dia. Panel + ID-Diluent II + Bio-Rad Laboratories Подбор IMMUNOHEMATOLOGY
1 карта = 6 проб на совместимость, Возможно постепенное использование Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY вм ест Со Со вм ест им о сть Проба на совместимость в геле по А им Со ост вм ь п ест о В им Фе ост рм ь п ент о D ны й т Не ест пря мо й А Ау ГТ ток онт рол ь Решения Био-Рад 1 карта = 1 проба на совместимость,
Решения Био-Рад Расширенный профиль антигенов ID-карта ID-Antigen Profile II ID-карта ID-Antigen Profile I п. 23 а Типирование эритроцитов по антигенам систем резус, Келл и других систем с помощью антител соответствующей специфичности; Кат. Номер 008610 Кат. Номер 008510 ID-карта ID-Antigen Profile III Тест сыворотки + Кат. Номер 008701 Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY Кат. Номер 008711
Благодарю за внимание Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY
Скачать презентацию Bio-Rad Laboratories IMMUNOHEMATOLOGY Особенности применения гелевой технологии для
6e573e60e5eb9ccaf3b0353467bd4712.ppt