Бесприборные тесты для подтверждения ВИЧ-Инфекции Дробченко А. Е. ЗАО «Биоград» , Санкт-Петербург, http: //www. biograd. ru © ЗАО «Биоград» , 2010 г. 1
Алгоритм тестирования В соответствии с диагностическим алгоритмом, утвержденным методическим письмом Минздравсоцразвития N 4174 -РХ от 4. 08. 2006 г. «Обнаружение антител к ВИЧ включает два этапа» • «На первом этапе проводится выявление суммарного спектра антител против антигенов ВИЧ с использованием различных тестов» • «На втором этапе методом иммунного блоттинга проводится определение антител к отдельным антигенам вируса. » © ЗАО «Биоград» , 2010 г.
Алгоритм тестирования (СП 3. 1. 5. 2826 -10) 4. 3. Стандартным методом лабораторной диагностики ВИЧинфекции служит определение антител/антигенов к ВИЧ с помощью ИФА. Для подтверждения результатов в отношении ВИЧ применяются подтверждающие тесты (иммунный, линейный блот). © ЗАО «Биоград» , 2010 г.
Алгоритм тестирования (СП 3. 1. 5. 2826 -10) 4. 4. 1. На первом этапе (скрининговая лаборатория). Если получен положительный результат в ИФА, анализ проводится последовательно еще 2 раза (с той же сывороткой и в той же тест-системе, вторая сыворотка запрашивается только в случае невозможности направления для дальнейшего исследования первой сыворотки). Если получены два положительных результата из трех постановок в ИФА сыворотка считается первичноположительной и направляется в референс-лабораторию (Лаборатория диагностики ВИЧ-инфекции центра по профилактике и борьбе со СПИД) для дальнейшего исследования. © ЗАО «Биоград» , 2010 г.
Алгоритм тестирования (СП 3. 1. 5. 2826 -10) 4. 4. 2. На втором этапе (референс-лаборатория). Первично положительная сыворотка повторно исследуется в ИФА во второй тест-системе другого производителя, отличающейся от первой по составу антигенов, антител или формату тестов, выбранной для подтверждения. При получении отрицательного результата сыворотка повторно исследуется в третьей тест-системе другого производителя, отличающейся от первой и второй по составу антигенов, антител или формату тестов. В случае получения отрицательного результата (во второй и третьей тест-системах) выдается заключение об отсутствии антител к ВИЧ. … © ЗАО «Биоград» , 2010 г.
Алгоритм тестирования (СП 3. 1. 5. 2826 -10) 4. 4. 2. На втором этапе (референс-лаборатория). … При получении положительного результата (во второй и/или третьей тест-системе) сыворотку необходимо исследовать в иммунном или линейном блоте. Результаты, полученные в подтверждающем тесте, интерпретируются как положительные, неопределенные и отрицательные. … © ЗАО «Биоград» , 2010 г.
Алгоритм тестирования (СП 3. 1. 5. 2826 -10) 4. 4. 2. На втором этапе (референс-лаборатория). … Референс-диагностика может проводиться также во ФГУН, на базе которых функционируют федеральный и окружные центры по профилактике и борьбе со СПИД, и в ФГУ Республиканская клиническая инфекционная больница (г. Санкт-Петербург). © ЗАО «Биоград» , 2010 г.
Алгоритм тестирования (СП 3. 1. 5. 2826 -10) 4. 4. 3. Положительными (позитивными) считаются пробы, в которых обнаруживаются антитела к 2 из 3 гликопротеинов ВИЧ (env, gag, pol). 4. 4. 4. Отрицательными (негативными) считаются сыворотки, в которых не обнаруживается антитела ни к одному из антигенов (белков) ВИЧ или имеется слабое реагирование с белком р 18. 4. 4. 5. Неопределенными (сомнительными) считаются сыворотки, в которых обнаруживаются антитела к одному гликопротеину ВИЧ и/или каким-либо протеинам ВИЧ. При получении неопределенного результата с белковым профилем включающим, белки сердцевины (gag) р 25, проводится исследование для диагностики ВИЧ-2. © ЗАО «Биоград» , 2010 г.
Алгоритм тестирования (СП 3. 1. 5. 2826 -10) 4. 4. 6. При получении отрицательного и сомнительного результата в иммунном или линейном блоте рекомендуется исследовать сыворотку в тест-системе для определения р24 антигена или ДНК/РНК ВИЧ. Если был выявлен антиген р24 или ДНК/РНК ВИЧ, повторное обследование в иммунном или линейном блоте проводится через 2, 4, 6 недель после получения первого неопределенного результата. © ЗАО «Биоград» , 2010 г.
Алгоритм тестирования (СП 3. 1. 5. 2826 -10) 4. 4. 7. При получении неопределенного результата проводятся повторные исследования на антитела к ВИЧ иммунном или линейном блоте через 2 недели, 3 и 6 месяцев. Если получены отрицательные результаты в ИФА, то дальнейшее исследование не требуется. Если через 6 месяцев после первого обследования вновь будут получены неопределенные результаты, а у пациента не будут выявлены факторы риска заражения и клинические симптомы ВИЧ-инфекции, результат расценивается как ложноположительный. (При наличии эпидемиологических и клинических показаний серологические исследования проводятся повторно по назначению лечащего врача или эпидемиолога). © ЗАО «Биоград» , 2010 г.
Подтверждающие тесты В рамках централизованных мероприятий для подтверждения результатов положительных по ВИЧ в ИФА закупались 2 вида подтверждающих тестов: «Лизатный иммуноблот» - Western Blot, спектр антигенов ВИЧ разделенных при помощи электрофореза. Антигены производятся из вирусного лизата. Полный спектр. «Рекомбинантный иммуноблот» - рекомбинантные или синтетические антигены ВИЧ. Антигены производятся отдельно и наносятся дискретно. © ЗАО «Биоград» , 2010 г.
Western Blot Антигены из вирусного лизата распределяются по молекулярным весам при помощи электрофореза Нитроцеллюлозная мембрана ВИЧ Гель Сильные стороны: • Полный спектр антигенов Слабые стороны: • Высокая стоимость • Высокий процент неопределенных результатов • Высокие требования к квалификации персонала © ЗАО «Биоград» , 2010 г.
Неопределенные результаты Производитель Наименование Тип Orgenics Ltd Immuno. Comb II HIV 1&2 Comb. Firm рекомбинантный Bio-Rad Кол-во Процент неопределенных /отрицательных результатов 4 / 154 1 2, 6% Genetic Systems лизатный HIV-1 Western Blot 28 / 176 2 32 / 298 3 Bio-Rad New Lav Blot I лизатный 53 / 419 4 Bio-Rad Pepti-Lav 1 -2 рекомбинантный 4 / 214 5 15, 9% 10, 7% 12, 6% 1, 9% Inno. Genetics Inno-LIA HIV I/II рекомбинантный 10 / 300 6 3, 3% Organon Lia. Tek HIV III рекомбинантный 10 / 146 7 6, 8% Chiron (Novartis Diagnostcs) RIBA HIV-1/HIV-2 Strip Immunoblot Assay рекомбинантный 22 / 548 8 4, 0% Ora Sure HIV-1 Western Blot лизатный 100 / 495 9 45 / 264 10 20, 2% 17, 0%
1. Инструкция по применению Immuno. Comb II HIV 1&2 Comb. Firm, стр. 4 2. Инструкция по применению GS HIV-1 Western Blot, стр. 24 - данные для группы высокого риска, образцы отрицательные по EIA (ИФА) 3. Инструкция по применению GS HIV-1 Western Blot, стр. 22 - данные для доноров крови, образцы отрицательные по EIA (ИФА) 4. Инструкция по применению New Lav Blot I, стр. 10 5. Инструкция по применению Pepti-Lav 1 -2, стр. 9 6. Описание продукции на сайте производителя 7. Validation of a new immunoblot assay (Lia. Tek HIV III) for confirmation of human immunodeficiency virus infection, Transfusion, 1998 Aug; 38(8): 776 -81. 8. Evaluation of Chiron HIV-1/HIV-2 Recombinant Immunoblot Assay, Journal of Clinical Microbiology, Nov. 1996, p. 2650– 2653 9. Инструкция по применению Ora Sure HIV-1 Western Blot, стр. 14 — данные для группы низкого риска 10. Инструкция по применению Ora Sure HIV-1 Western Blot, стр. 14 — данные для группы высокого риска © ЗАО «Биоград» , 2010 г.
Наименование Immuno. Comb® II HIV 1&2 Comb. Firm рекомбинантный Биосервис, "Блот. ВИЧ 1/2 +0" рекомбинантный Определяемые антитела: Оборудование / Конъюгат подготовка к Env к Gag к Pol к Env растворов ВИЧ 1 ВИЧ 2 gp 120, p 24 p 31 gp 36 не требует / Конъюгат с gp 41 не требует (все щелочной растворы готовы фосфатазой к применению) gp 160, p 24/ gp 41 p 17 Эколаб "ИФА Лайн- gp 160, gp 41 Блот ВИЧ-1, 2" рекомбинантный p 24 Время анализа 1 час p 51 gp 110/ вакуумный насос Конъюгат с gp 38 и шейкер / пероксидазой приготовление хрена растворов 18 -20 часов p 51 gp 36 вакуумный насос Конъюгат с и шейкер / пероксидазой приготовление хрена растворов 18 -20 часов - вакуумный насос Конъюгат с и шейкер / щелочной восстановление фосфатазой из концентрата 3 часа Bio-Rad “NEW LAV спектр gp 160, p 24, p 31, BLOT I” gp 120 p 40, p 51, лизатный gp 41 p 55, p 66 p 17 © ЗАО «Биоград» , 2010 г.
Критерии положительного результата (Western Blot): ВОЗ (рекомедованы в письме два env (gp 41, gp 160, gp 120) Минздравсоцразвития N 4174 -РХ от 4. 08. 2006 г. ) CDC любые два из: p 24, gp 41, gp 160/120 Американский Красный Крест по одной полосе из env, gag и pol CRSS Консорциум по стандартизации ретровирусной серологии gag или pol И env (p 24 или p 31) И (gp 41 или gp 120/160) © ЗАО «Биоград» , 2010 г.
Иммуно. Комб II ВИЧ 1+2 Комб. Фирм Immuno. Comb® II HIV 1&2 Comb. Firm Наименование Immuno. Comb® II HIV 1&2 Comb. Firm рекомбинантный Определяемые антитела: к Env к Gag к Pol к Env ВИЧ 1 ВИЧ 2 gp 120, p 24 p 31 gp 36 gp 41 • Время анализа – 1 час • Не требует разведения реагентов (все реагенты готовы к применению) gp 120 gp 41 gp 36 Внутренний контроль p 24 p 31 © ЗАО «Биоград» , 2010 г. 17
Тест Иммуно. Комб. Фирм разрешен для подтверждения наличия антител к ВИЧ (приказ МЗ РФ № 292 от 30. 07. 2001). Результаты мультицентровых испытаний (Израиль, Франция, Бельгия, Бразилия, Сенегал) * - включая 15 положительных по ВИЧ-1 группы О Без учета неопределенных: чувствительность 100%, © ЗАО «Биоград» , 2010 г. специфичность 100% 18
Исследование MSF (Врачи без границ) Проводилось в 2006 году в Демократической республике Конго организацией MSF (Врачи без границ) 2864 клинических образца исследовались на 2 экспресс тестах, из 365 образцов, положительных по обоим тестам, 229 потдверждались одновременно на лизатном иммуноблоте (WB) и на Immuno. Comb® II HIV 1&2 Comb. Firm (IC). Из 229 образцов 205 были положительными в WB, а 24 – отрицательными или неопределенными. При разбиении на положительные и отрицательные/неопределенные результаты WB и IC © ЗАО «Биоград» , 2010 г. совпадали в 227 из 229 случаев.
Типовой состав набора Иммуно. Комб © ЗАО «Биоград» , 2010 г. 20
Диагностика ВИЧ Иммуно. Комб II HIV 1&2 Bispot – скрининговый Иммуно. Комб II HIV 1&2 Tri. Spot Ag-Ab – АГ-АТ Иммуно. Комб II HIV 1&2 Comb. Firm – подтверждающий © ЗАО «Биоград» , 2010 г. 21
Диагностика вирусных гепатитов Иммуно. Комб II HBs. Ag 90’ Иммуно. Комб II Anti-HBs Иммуно. Комб II HBc Ig. M Иммуно. Комб II HBc Ig. G Иммуно. Комб II HCV Иммуно. Комб II HAV Ig. M Иммуно. Комб II HAV Ab © ЗАО «Биоград» , 2010 г. Внутренний контроль Коровый антиген ВГС NS 3 и NS 4 NS 5 22
Технология Иммуно. Комб позволяет диагностировать широкий спектр инфекций: ВИЧ, HTLV, Гепатиты А, В, С, Цитомегалию, Токсоплазмоз, Хламидиоз, Краснуху, Хеликобактериоз, тропические инфекции. © ЗАО «Биоград» , 2010 г. 23
Схема постановки анализа 1. Для индивидуального тестирования гребешок можно согнуть и отломить необходимое количество зубцов. 4. Гребешок перемещается из ряда в ряд ванночки в соответствии с инструкцией (промывки и связывание с конъюгатом). 2. В ряд А ванночки вносятся образцы (сыворотка, плазма или цельная кровь) и контроли. 5. Цветная реакция в ряду F. 3. Гребешок вставляется в ряд А и инкубируется (реакция антиген-антитело). 6. Результат анализа в виде окрашенных точек. Верхняя точка: внутренний контроль. Нижняя точка и (или) средняя точки появляются в случае наличия - инфекции. © ЗАО «Биоград» , 2010 г. 24
Тесты Иммуно. Комб сертифицированы СЕ и широко используются более чем в ста странах мира. Как достоверные, высокочувствительные и специфичные тесты Иммуно. Комб отобраны для программ ВОЗ, UNAIDS, Красного Креста, допущены FDA (США) для поставок по специальным программам фонда Клинтона. © ЗАО «Биоград» , 2010 г. 25
Спасибо за внимание ЗАО «Биоград» 18 лет в России Адрес: 197101, г. Санкт-Петербург, Петровский пр. , д. 14, 19 -Н тел. /факс: (812) 325 21 71, 325 21 70 (многоканальные) http: //www. biograd. ru biograd@biograd. ru © ЗАО «Биоград» , 2010 г. 26
Скачать презентацию Бесприборные тесты для подтверждения ВИЧ-Инфекции Дробченко А Е
4ebcdb9ee1d2e7814450b2fe29358da3.ppt