Бесклеточные системы трансляции.pptx
- Количество слайдов: 22
Бесклеточные системы трансляции ВЫПОЛНИЛА СТУДЕНТКА МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТА 5 КУРСА 3 ГРУППЫ УШАНОВА Г. А.
Бесклеточные системы трансляции Бесклеточная система — смесь веществ, содержащая отдельные клеточные компоненты или структуры, например, рибосомы. Различные бесклеточные системы используются для изучения отдельных биохимических реакций или процессов синтеза макромолекул.
Бесклеточные системы создаются для моделирования биохимических процессов, происходящих в живом организме, и воспроизводит некоторые особенности жизнедеятельности клетки. В генной инженерии бесклеточные белоксинтезирующие системы используются для исследования кодирующего потенциала и механизмов экспрессии клонированных генов in vitro, и на промежуточных этапах конструирования рекомбинантных генов для идентификации м. РНК или фрагментов ДНК по кодируемым белкам.
Белоксинтезирующая система включает 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. набор всех 20 аминокислот, входящих в состав белковых молекул; минимум 20 разных т. РНК, обладающих специфичностью к определенному ферменту и определенной аминокислоте; набор минимум 20 различных ферментов — аминоацил-т. РНКсинтетаз, также обладающих двойной специфичностью к какой -либо определенной аминокислоте и к одной т. РНК; рибосомы (точнее, полисомы, состоящие из 4— 12 монорибосом с присоединенной к ним м. РНК); АТФ и АТФ-генерирующую систему ферментов; ГТФ, принимающий специфическое участие в стадиях инициации и элонгации синтеза белка в рибосомах; ионы Mg 2+ в концентрации 0, 005— 0, 008 М; м. РНК в качестве главного компонента системы, несущей информацию о структуре белка, синтезирующегося в рибосоме; белковые факторы, участвующие в синтезе на разных уровнях трансляции.
Состав Прокариоты Эукариоты Активация аминокислот 1) 20 аминокислот 2) 20 аминоацил-т. РНКсинтетаз 3) Минимум 20 т. РНК 4) АТФ и Mg 2+ 5) Буферные системы для поддержания р. Н 6) К+ или NH 4+ 1) 20 аминокислот 2) 20 аминоацил т-РНКсинтетаз 3) Минимум 20 т-РНК 4) АТФ и Mg 2+ 5) Буферные системы для поддержания р. Н 6) К+ или NH 4+ Инициация 1) м-РНК 2) Инициаторная аминоацил-т. РНК (Nфомилметионилт. РНК) 3) Инициирующий кодон в молекуле м. РНК (АУГ) 4) 30 S и 50 S рибосомные субчастицы 1) м-РНК 2) Инициаторная аминоацил-т. РНК (Nметионил-т. РНК) 3) Инициирующий кодон в молекуле м. РНК (АУГ) 4) 40 S и 60 S рибосомные субчастицы Факторы инициации IF-1, IF-2 и IF-3, ГТФ, Mg 2+ Факторы инициации e. IF-1, e. IF-2 Aи e. IF-3, e. IF-4 A, e. IF-4 B, e. IF-
Состав Прокариоты Эукариоты Элонгация 1) Инициирующий комплекс (функциональня 70 S рибосома) 2) Специфические т. РНК, определяемые кодонами 3) Факторы элонгации: EF-Tu, EF-Ts, EF-G, ГТФ, Mg 2+ 1) Инициирующий комплекс (функциональня 80 S рибосома) 2) Специфические т. РНК, определяемые кодонами 3) Факторы элонгации: e. EF-1α, e. EF-1βγ, e. EF-2, ГТФ, Mg 2+ Терминация 1) Терминирующие кодоны в молекуле м. РНК 2) Факторы терминиции (рилизинг-факторы): RF-1, RF-2, RF-3, АТФ 1) Терминирующие кодоны в молекуле м. РНК 2) Факторы терминиции (рилизинг-факторы): e. RF, АТФ Процессинг и формирование третичной структуры Специфические ферменты и кофакторы, вызывающие освобождение инициирующих
Прокариотические системы синтеза белка Наибольшее распространение получили системы на основе экстрактов клеток E. coli. Важное условие функционирования бесклеточных систем биосинтеза белка является нативное состояние рибосом и факторов трансляции. В качестве источников этих компонентов в бактериальных бесклеточных системах чаще всего используют экстракты соответствующих клеток. Бактериальные клетки выращивают на богатой питательной среде, суспендируют в буфере и разрушают тем или иным способом. Лизат центрифугируют при 30 000 g. При этом в супернатанте (так называемом SЗОэкстракте) остаются рибосомы и остальные белковые факторы трансляции, необходимые для функционирования системы. Кроме того, в нем содержатся бактериальные ДНК и м. РНК, которые, если от них не освободиться, приводят к неспецифическому синтезу белка в бесклеточной системе.
Прокариотические системы синтеза белка Экстракты бактериальных клеток S 30 и S 1 OO, кроме всех необходимых факторов трансляции, содержат и основные компоненты системы транскрипции, включая РНКполимеразу, фактор терминации транскрипции p, CRPбелок и т. п. Поэтому для создания ДНК- зависимой системы сопряженной транскрипции и трансляции, в которой происходит полная экспрессия генов, находящихся под контролем бактериальных регуляторных элементов не требуется введения в нее дополнительных белков. Достаточно внесения в систему экзогенной ДНК-матрицы, транскрибируемой бактериальной РНК-полимеразой, а также четырех рибонуклеозидтрифосфатов, чтобы начала активно синтезироваться м. РНК и одновременно транслироваться рибосомами. В итоге удается синтезировать высокомолекулярные белки, обладающие ферментативной активностью
Прокариотические системы синтеза белка Экстракты бактериальных клеток содержат многочисленные нуклеазы и протеолитические ферменты, которые понижают эффективность синтеза белков in vitro, разрушая м. РНК и образуемые полипептиды. Для преодоления этих затруднений в бесклеточных системах используют экстракты мутантных бактериальных клеток, дефектных по РНКазам и полинуклеотидфосфорилазе, а в сами бесклеточные системы при необходимости вводят ингибитор РНКазы из плаценты человека или ингибиторы протеиназ: лейпептин, пепстатин, химостатин и т. п.
Прокариотические системы синтеза белка Не существует больших ограничений на первичную структуру м. РНК, транслируемых в бактериальных бесклеточных системах. Единственным необходимым условием их эффективной трансляции является отсутствие совершенной вторичной структуры или какихлибо особо прочных кооперативных спиральных участков. Вторичную структуру транслируемых м. РНК обычно разрушают кратковременным прогреванием с последующим быстрым охлаждением непосредственно перед внесением ее в пробы.
Прокариотические системы синтезабелка GTP относится к обязательным компонентам бесклеточной белоксинтезирующей системы. Он не может быть заменен на любой другой из известных рибонуклеозидтрифосфатов и необходим для м. РНК-зависимого связывания аминоацил-т. РНК с рибосомами и транслокации. Поскольку при трансляции происходит непрерывное расходование GTP, а образующийся при этом GDP является ингибитором трансляции, в процессе функционирования бесклеточной системы осуществляют постоянную регенерацию GTP. Для этого применяют АТР в качестве донора фосфатных групп, которая регенерируется путем переноса фосфатной группы вводимого в бесклеточную систему фосфоэнолпирувата с помощью пируватфосфокиназы. Энергия макроэргических связей АТР используется также при аминоацилировании т. РНК аминоацил-т. РНК-синтетазами. В том случае, если создается бесклеточная система сопряженной транскрипции и трансляции, для осуществления синтеза РНК в нее вводятся еще два недостающих рибонуклеозидтрифосфата: UTP и СТР.
Прокариотические системы синтеза белка Для функционирования бесклеточных белоксинтезирующих систем необходимо обеспечивать в них определенные ионные условия, особенно концентрацию ионов Mg 2+. Достаточно изменения оптимальной концентрации Mg 2+ в системе на 1 -2 м. М, чтобы в ней перестали синтезироваться полипептиды, обладающие ферментативной активностью. Влияние ионов Mg 2+ на суммарное включение аминокислот в синтезируемые полипептидные цепи проявляется в меньшей степени, что, по-видимому, объясняется нарушением точности включения аминокислот в белки при неоптимальных концентрациях ионов Mg 2+. В системах in vitro ионы Mg 2+ могут быть заменены на ионы Са 2+ и даже Мn 2+, а также частично замещены полиаминами: спермидином или спермином, которые благоприятно влияют на трансляцию и образование нативных белков.
Прокариотические системы синтеза белка Биосинтез белка в бесклеточных системах происходит также в присутствии ионов K+ или NH 4+, оптимальные концентрации которых составляют около 100 м. М. Ионы Na+ ингибируют трансляцию, а ацетат-анионы в используемых солях предпочтительнее анионов Сl-. Ионы Mg 2+, К+ и NH 4+ необходимы для ассоциации субчастиц рибосом и поддержания их в компактной форме.
Эукариотические системы синтеза белка Среди бесклеточных систем биосинтеза белка, пригодных для непосредственной трансляции м. РНК высших организмов, наиболее часто применяются белоксинтезирующие системы из ретикулоцитов кроликов, зародышей пшеницы и культивируемых соматических клеток различного происхождения. Системы всех трех типов могут быть использованы с одинаковым успехом для трансляции разнообразных м. РНК и, как правило, не обнаруживают видоспецифичности. Основные принципы конструирования прокариотических белоксинтезирующих систем применяют и для получения систем биосинтеза белков высших организмов. Специфика последних связана, прежде всего, с биологическими особенностями объектов, которые служат источником белковых компонентов систем, а также с различиями механизмов биосинтеза белка у прокариот и эукариот
Эукариотические системы синтеза белка Ретикулоциты - безъядерные предшественники эритроцитов человека и животных, осуществляют активный синтез гемоглобина и обладают всеми необходимыми компонентами белкового синтеза. Отсутствие ядер дает возможность получать бесклеточные экстракты, минимально загрязненные геномной ДНК. Эти особенности ретикулоцитов животных делают их излюбленным источником бесклеточных экстрактов, способных осуществлять эффективную трансляцию разнообразных экзогенных м. РНК.
Особенности бесклеточной белоксинтезирующей системы из ретикулоцитов кроликов Для регенерации АТР в качестве доноров фосфатных групп используют креатинфосфат универсальный аккумулятор энергии в макроэргических связях у большинства позвоночных, а сам перенос групп осуществляется вводимой в систему креатинфосфокиназой. Для предотвращения ингибирования трансляции в процессе синтеза белка в систему вводят гемин.
Особенности белоксинтезирующей системы из зародышей пшеницы Функционирование системы из зародышей пшеницы и ее состав существенно не отличаются от таковых ретикулоцитарной системы биосинтеза белка. Различия заключаются главным образом в методах получения бесклеточных экстрактов. Зародыши обычно выделяют из сухих зерен озимой пшеницы. Преимуществами этих бесклеточных белоксинтезирующих систем перед другими являются возможность длительного хранения и доступность исходного биологического материала (зерен сортовой пшеницы), что обеспечивает воспроизводимость получаемых результатов и не требует проведения экспериментов с лабораторными животными.
Проточные системы синтеза белка В лаборатории Александра Сергеевича Спирина в 1988 г. удалось получить эффективную бесклеточную белоксинтезирующую систему.
Проточные системы синтеза белка В их модификации бесклеточные экстракты бактериальных или эукариотических клеток помещают в ячейку, закрытую с двух сторон полупроницаемыми мембранами. Размер позволяет проходить через мембраны вместе с током жидкости низкомолекулярным химическим веществам и небольшим белкам. Ячейку с компонентами для бесклеточной трансляции инкубируют при обычной температуре. С одной стороны в ячейкуреактор со скоростью примерно 1 мл/ч непрерывно поступают ингредиенты, расходуемые в процессе биосинтеза белка (аминокислоты, АТР, GTP), с другой стороны выходят синтезированные белковые продукты (если их молекулярная масса и отсутствие способности к агрегации позволяют пройти через поры мембраны).
Проточные системы синтеза белка С разработкой проточной бесклеточной белоксинтезирующей системы стало возможным проводить биосинтез рекомбинантных белков в препаративных количествах in vitro. Такая система позволяет синтезировать в больших количествах полипептиды, подверженные быстрой внутриклеточной деградации протеиназами или образующие тельца включения в живых клетках. Проточная система может быть полезна для получения белков, обладающих цитотоксической активностью, или других рекомбинантных полипептидов, для которых нежелательны артефактные посттрансляционные модификации, происходящие in vivo. В таких системах удалось получить препаративные количества функционально активного интерлейкина 6 человека.
Список литературы http: //humbio. ru http: //www. studychem. com Б. Хеймс и С. Хиггинс «Транскрипция и трансляция. Методы. »
Бесклеточные системы трансляции.pptx