Белки Природа Белков n A. Структура n n Белки – линейные неразветвленные полимеры образованные 20 аминокислотами. B. Размеры. n n Масса мономерного белка обычно 10 -50 kdal, хотя имеются белки массой менее 350 dal and более чем 1000 kdal Олигомрные белки обычно имееют массу 200 kdal и более
Function. Proteins serve a wide range of functions in living organisms. A few of their functions include n n n Enzymatic catalysis—Most enzymes are proteins. Transport and storage of small molecules and ions Structural elements of the cytoskeleton. Proteins make up the cytoskeleton, which: n n n Structure of skin and bone. Proteins such as collagen, the most abundant protein in the body, give these structures high tensile strength. Immunity. The immune defense system is composed of proteins such as antibodies, which mediate a protective response to pathogens. Hormonal regulation. Hormones coordinate the metabolic actions within the body n n n Provides strength and structure to cells Forms the fundamental mechanistic components for intracellular and extracellular movement Some hormones are proteins [e. g. , somatotropin (pituitary growth hormone) and insulin]. The cellular receptors that recognize hormones and neurotransmitters are proteins. Control of genetic expression. Activators, repressers, and many other regulators of gene expression in prokaryotes and eukaryotes are proteins.
Post-translational modification n n Гидроксилирование - добавление (—OH) групп к некоторым остаткам пролина и лизина в коллагене и желатине Метилирование – добавление (—CH 3) группы к лизину и гистидину в мышечном миозине Карбоксилирование - добавление (—COOH) групп к глутамату в blood clotting and bone proteins Фосфорилирование (—PO 3) groups to some serine, threonine, and tyrosine molecules. Дефосфорилирование is a common method of regulating the activity of many enzymes, cell-surface receptors, and other regulatory molecules.
PEPTIDES AND POLYPEPTIDES n n Formation. The linking together of amino acids produces peptide chains, also called polypeptides if many amino acids are linked. The peptide bond is the bond formed between the -carboxyl group of one amino acid and the -amino group of another. In the process, water is removed
Третичная структура белка § Способ свертывания полипептидных цепей глобулярных белков в компактную сферическую глобулу мы будем называть третичной структурой n это трехмерная пространственная структура, образующаяся за счет взаимодействий между радикалами аминокислот, которые могут располагаться на значительном расстоянии друг от друга в пептидной цепи n Связи, образующие третичную структуру белка: Слабые • Водородные • Электростатические • гидрофобные и стерические • дисульфидные
n. Конформационная лабильность белков — это способность белков к небольшим изменениям конформации за счет разрыва одних и образования других слабых связей. n n Гидрофобные радикалы аминокислот имеют тенденцию к объединению внутри глобулярной структуры белков с помощью так называемых гидрофобных взаимодействий и межмолекулярных ван-дер-ваальсовых сил, образуя плотное гидрофобное ядро. Гидрофильные ионизированные и неионизированные радикалы аминокислот в основном расположены на поверхности белка и определяют его растворимость в воде. Гидрофильные аминокислоты, оказавшиеся внутри гидрофобного ядра, могут взаимодействовать друг с другом с помощью ионных и водородных связей
Фолдинг белков Формирование пространственных структур белка осуществляется путем самосборки - самопроизвольного процесса, при котором пептидная цепь стремится принять в растворе конформацию с наименьшей свободной энергией.
Мотив ? n Мотив в аминокислотной последовательности - набор консервативных остатков, важных для функции белка и расположенных на определенном (обычно коротком) расстоянии друг от друга в последовательности. n Мотив структуры (структурный мотив) – часто встречающийся в белках элемент пространственной структуры ( -спираль, -шпилька, -поворот). В общем случае, структурные мотивы не обязательно соответствуют мотивам в аминокислотным последовательностях.
Фолдинг третичной структуры МОТИВЫ -спираль-поворот- -спираль Греческий ключ ß- -ß
По наличию -спиралей и -структур глобулярные белки могут быть разделены на 4 категории: n n В первую категорию включены белки, в которых имеются только -спирали, например миоглобин и гемоглобин. Во вторую категорию включены белки, в которых имеются -спирали и -структуры. При этом - и -структуры часто образуют однотипные сочетания, встречающиеся в разных индивидуальных белках. В третью категорию включены белки, имеющие только вторичную -структуру. Такие структуры обнаружены в иммуноглобулинах, в ферменте супероксиддисмутазе В четвертую категорию включены белки, имеющие в своем составе лишь незначительное количество регулярных вторичных структур. К таким белкам можно отнести небольшие богатые цистином белки или металлопротеины
Домен – единица эволюции, структуры и функции белков. Домен – компактная, относительно независимо сворачивающаяся структура, относительно консервативная в процессе эволюции. Белки могут состоять из одного или многих доменов. nitrogen fixation positive activator protein ДОМЕННАЯ СТРУКТУРА БЕЛКОВ n n Длинные полипептидные цепи часто складываются в несколько компактных, относительно независимых областей. Они имеют самостоятельную третичную структуру, напоминающую таковую глобулярных белков, и называются доменами. Благодаря доменной структуре белков легче формируется их трехмерная структура.
АКТИВНЫЙ ЦЕНТР БЕЛКА И СПЕЦИФИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКА С ЛИГАНДОМ Центр связывания белка с лигандом, или активный центр n n На поверхности глобулы образуется участок, который может присоединять к себе другие молекулы, называемые лигандами. Центр связывания с лигандом, или активный центр, формируется из радикалов аминокислотных остатков, сближенных на уровне третичной структуры. В линейной пептидной цепи они могут находиться на расстоянии, значительно удаленном друг от друга.
n n n Белки проявляют высокую специфичность (избирательность) при взаимодействии с лигандом. Высокая специфичность взаимодействия белка с лигандом обеспечивается комплементарностью структуры активного центра структуре лиганда. Комплементарность — это пространственное и химическое соответствие взаимодействующих поверхностей. В основе функционирования белков лежит их специфическое взаимодействие с лигандами.
РОЛЬ ДОМЕННОЙ СТРУКТУРЫ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ БЕЛКОВ n n n Центры связывания белка с лигандом часто располагаются между доменами (например, центр связывания трипсина с его лигандом пищевым белком). Разные домены в белке могут перемещаться относительно друга при взаимодействии с лигандом (например, в молекуле гексокиназы). В некоторых белках домены выполняют самостоятельные функции, связываясь с различными лигандами.
ОЛИГОМЕРНЫЕ БЕЛКИ. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ И РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИЙ n n Многие белки имеют в своем составе несколько полипептидных цепей. Такие белки называют олигомерными, а отдельные цепи — протомерами. Протомеры в олигомерном белке соединены множеством слабых, нековалентных связей (гидрофобных, ионных, водородных). Взаимодействие протомеров осуществляется благодаря комплементарности их контактирующих поверхностей. Взаимодействие одного протомера с другими можно рассматривать как частный случай взаимодействия белка с лигандом. Каждый протомер служит лигандом для других протомеров
Четвертичная структура n n Под термином четвертичной структуры понимают расположение полипептидных цепей, входящих в состав отдельных субъединиц, относительно друга, т. е. способ их совместной укладки и упаковки с образованием нативной конформации олигомерного белка Количество и порядок соединения протомеров в белке называется четвертичной структурой Связи, образующие четвертичную структуру белка n Слабые nводородные nэлектростатические nгидрофобные и стерические nдисульфидные
Количество протомеров в белках может сильно варьировать: n n n гемоглобин содержит 4 протомера, фермент аспартаттранскарбамоилаза — 12 протомеров, в белок вируса табачной мозаики входит 2120 протомеров,
ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ОЛИГОМЕРНЫХ БЕЛКОВ n n n Олигомерные белки могут содержать разное количество протомеров (например, димеры, тетрамеры, гексамеры и т. д. ). В состав олигомерных белков могут входить одинаковые или разные протомеры, например гомодимеры - белки содержащие 2 одинаковых протомера, гетеродимеры - белки, содержащие 2 разных протомера. Различные по структуре протомеры могут связывать разные лиганды.
Кооперативность n n Взаимодействие одного протомера со специфическим лигандом вызывает конформационные изменения всего олигомерного белка и изменяет сродство других протомеров к лигандам. Это явление носит название кооперативных изменений конформации протомеров.
n У олигомерных белков появляется новое по сравнению с одноцепочечными белками свойство — способность к аллостерической регуляции их функций.
Миоглобин (Mb) n n n - белок, находящийся в красных мышцах. Участвует в создании запасов 02. Содержит белковую часть — апо. МЬ и небелковую часть — гем. Первичная структура апо. МЬ представлена последовательностью из 153 аминокислот. Вторичная структура содержит 8 -спиралей (называемых латинскими буквами от А до Н), содержащих от 7 до 23 аминокислот. Третичная структура имеет вид компактной глобулы, образованной за счет петель и поворотов в области неспирализованных участков белка
Гемоглобин — олигомерный белок, функция которого регулируется различными лигандами n n n Гемоглобин (Нb) — сложный олигомерный белок, содержащийся в эритроцитах. Он состоит из 4 протомеров, соединенных нековалентными связями. Нb — белок, родственный миоглобину Вторичная и третичная структуры миоглобина и протомеров НЬ очень сходны, несмотря на то что в первичной структуре полипептидных цепей идентичны только 24 аминокислотных остатка (каждый протомер содержит 8 ос-спиралей, обозначаемых буквами от А до Н). Следовательно, белки, значительно различающиеся по аминокислотной последовательности, могут приобретать сходные пространственные структуры. Каждый протомер Нb в белке связан с небелковой частью — гемом и 3 другими протомерами. Соединение белковой части Нb с гемом аналогично таковому у миоглобина: гидрофобные части гема окружены гидрофобными радикалами аминокислот, за исключением Гис F 8 и Гис Е 7, которые расположены по обе стороны от плоскости гема и играют важную роль в связывании гемоглобина с 02.
Основная функция гемоглобина транспорт 02 из легких в ткани n Структура гемоглобина обеспечивает: n n n быстрое насыщение гемоглобина кислородом в легких; способность НЬ отдавать 02 в капиллярах тканей при относительно высоком парциальном давлении 02 (20— 40 мм рт. ст. ); возможность регуляции сродства НЬ к 02, что отличает его от близкого по структуре, но мономерного белка — миоглобина.
Heme and its role in modulating protein structure
Денатурация белков n n n - это разрушение их нативной конформации, вызванное разрывом слабых связей, стабилизирующих пространственные структуры, при действии денатурирующих агентов. Денатурация сопровождается потерей биологической активности белка. Уникальная трехмерная структура каждого белка разрушается, и все молекулы одного белка приобретают случайную конформацию, т. е. отличную от других таких же молекул. Радикалы аминокислот, формирующие активный центр белка, оказываются пространственно удаленными друг от друга, т. е. разрушается специфический центр связывания белка с лигандом. Гидрофобные радикалы, обычно находящиеся в гидрофобном ядре глобулярных белков, при денатурации оказываются на поверхности молекулы, тем самым создаются условия для агрегации белков. Агрегаты белков выпадают в осадок. При денатурации белков не происходит разрушения их первичной структуры.
Реагенты и условия, вызывающие денатурацию белков Денатурирующие агенты Особенности действия реагента Высокая температура (выше 60 °С) Разрушение слабых связей в белке Кислоты и щелочи Изменение ионизации ионогенных групп, разрыв ионных и водородных связей Мочевина Разрушение внутримолекулярных водородных связей в результате образования водородных связей с мочевиной Спирт, фенол, хлорамин Разрушение гидрофобных и водородных связей Соли тяжелых металлов Образование нерастворимых солей белков и ионов тяжелых металлов
Применение денатурирующих агентов в биологических исследованиях и медицине n n В биохимических исследованиях перед определением в биологическом материале низкомолекулярных соединений обычно из раствора удаляют белки. Для этой цели чаще всего используется трихлоруксусная кислота (ТХУ). После добавления ТХУ в раствор денатурированные белки выпадают в осадок и легко удаляются фильтрованием В медицине денатурирующие агенты часто применяют для стерилизации медицинского инструмента и материала в автоклавах (денатурирующий агент - высокая температура) и в качестве антисептиков (спирт, фенол, хлорамин) для обработки загрязненных поверхностей, содержащих патогенную микрофлору
МНОГООБРАЗИЕ БЕЛКОВ ГОМОЛОГИЧНЫЕ БЕЛКИ n Гомологичными называют белки, выполняющие у разных видов одинаковые функции, например гемоглобин у всех позвоночных осуществляет транспорт 02, цитохром с — митохондриальный белок, участвующий в процессах биологического окисления
Гомологичные белки большинства видов: n n имеют одинаковую или очень близкую молекулярную массу; во многих положениях содержат одни и те же аминокислоты, называемые инвариантными остатками; в некоторых положениях наблюдаются значительные различия аминокислот — так называемые вариабельные аминокислотные остатки; содержат гомологичные последовательности — совокупность сходных черт в аминокислотной последовательности сравниваемых белков (кроме идентичных аминокислот, эти последовательности содержат разные, но близкие по физико-химическим свойствам аминокислотные радикалы).
n n n Цитохром с — митохондриальный белок, участвующий в биологическом окислении. Установлена его аминокислотная последовательность более чем у 60 видов. В 27 положениях находятся инвариантные аминокислотные остатки. Цитохромы с дрожжей и лошади различаются по 48 аминокислотным остаткам, курицы и утки — по 2 аминокислотам, курицы и индейки идентичны.
Сравнение аминокислотной последовательности гомологичных белков выявило: n n n консервативные, инвариантные аминокислотные остатки важны для формирования уникальной пространственной структуры и биологической функции данных белков; наличие гомологичных белков говорит об общем эволюционном происхождении видов; число вариабельных аминокислотных остатков в гомологичных белках пропорционально филогенетическим различиям между сравниваемыми видами; в некоторых случаях даже небольшие изменения аминокислотной последовательности могут вызвать нарушения свойств и функций белков; но далеко не все изменения аминокислотной последовательности вызывают нарушения биологических функций белков; наибольшие нарушения структуры и функции белков возникают при замене аминокислот: n n n входящих в ядро сворачивания (набор аминокислот, с которых начинается формирование конформации); входящих в состав активного центра; на участках пересечения полипептидной цепи при образовании третичной структуры
СЕМЕЙСТВА БЕЛКОВ n n В ходе эволюции в пределах одного биологического вида замены аминокислотных остатков могут приводить к возникновению разных белков, выполняющих родственные функции и имеющих гомологичные последовательности аминокислот. Они имеют поразительно сходные конформации: количество и взаиморасположение -спиралей и/или -структур, большинство поворотов и изгибов полипептидных цепей похожи или идентичны.
Белки, имеющие гомологичные участки полипептидной цепи, сходную конформацию и родственные функции, выделяют в семейства белков. n Примеры семейств белков: n n n - сериновые протеиназы; - семейство иммуноглобулинов; - семейство миоглобина.
Классификации белков n n n По форме молекул белки можно разделить на две большие группы — глобулярные (имеющие сферическую форму) и фибриллярные (удлиненной формы). По наличию или отсутствию в белке неаминокислотной части они делятся на простые (состоящие только из аминокислот) и сложные (имеющие в своем составе компонент неаминокислотной природы) По функциям, выполняемым белками, их можно разделить на структурные, сократительные транспортные, каталитические, защитные, рецепторные, регуляторные и др.
СУПЕРСЕМЕЙСТВО ИММУНОГЛОБУЛИНОВ n n n В работе иммунной системы огромную роль играют белки суперсемейства иммуноглобулинов, которое включает в себя 3 семейства белков: антитела (иммуноглобулины), рецепторы Т-лимфоцитов, белки главного комплекса гистосовместимости - МНС 1 -го и 11 -го классов (major histocompatibility complex). Все они имеют доменное строение, состоят из гомологичных иммуноподобных доменов и выполняют сходные функции — взаимодействуют с чужеродными структурами, либо растворенными в крови, лимфе или межклеточной жидкости (антитела), либо находящимися на поверхности клеток (собственных или чужеродных). Антитела — специфические белки, вырабатываемые Влимфоцитами в ответ на попадание в организм чужеродной структуры, называемой антигеном.
Особенности строения антител n n n Простейшие молекулы антител состоят из 4 полипептидных цепей: 2 идентичных легких — L, содержащих около 220 аминокислот и 2 идентичных тяжелых - Н, состоящих из 440 -700 аминокислот. Все 4 цепи антитела соединены множеством некова-лентных и 4 дисульфидными связями. Легкие цепи антитела состоят из 2 доменов: вариабельного (VL), находящегося на N-концевой области полипептидной цепи, и константного (CL), расположенного на С-конце. Тяжелые цепи обычно имеют 4 домена: один вариабельный (Vc), находящийся на N-конце, и 3 константных (СН 1, СН 2, СH 3). Каждый домен иммуноглобулина имеет р-складча-тую суперструктуру, в которой 2 остатка цистеина соединены дисульфидной связью. Между 2 константными доменами СН 1 и СН 2 имеется участок, содержащий большое количество остатков пролина, которые препятствуют формированию вторичной структуры и взаимодействию соседних Н-цепей на этом отрезке. Эта шарнирная область придает молекуле антитела гибкость. Между вариабельными доменами тяжелых и легких цепей находятся 2 идентичных антигенсвязывающих участка, поэтому такие антитела часто называют бивалентами.
n n n В связывании антигена с антителом участвует не вся аминокислотная последовательность вариабельных участков обеих цепей, а всего лишь 20— 30 аминокислот, расположенных в гипервариабельных областях каждой цепи. Именно эти области определяют уникальную способность каждого вида антитела взаимодействовать с соответствующим комплементарным антигеном. Антитела — одна из линий защиты организма против внедрившихся чужеродных организмов. Их функционирование можно разделить на два этапа: первый этап — узнавание и связывание антигена на поверхности чужеродных организмов, которые происходят благодаря наличию в структуре антитела антигенсвязывающих участков; второй этап — инициация процесса, благодаря которому антиген инактивируется и разрушается. Специфичность второго этапа зависит от класса антител. Существует 5 классов тяжелых цепей, отличающихся по строению константных доменов: а, 5, е, у и ц, в соответствии с которыми различают 5 классов иммуноглобулинов: A, D, E, G и М. Особенности строения тяжелых цепей придают шарнирным участкам и С-концевым областям тяжелых цепей характерную для каждого класса конформацию. После связывания антигена с антителом кон-формационные изменения константных доменов определяют путь удаления антигена в организме.
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ И МЕТОДЫ ИХ РАЗДЕЛЕНИЯ Индивидуальные белки различаются по физико-химическим свойствам: n n n форме молекул; молекулярной массе; суммарному заряду, величина которого зависит от соотношения анионных и катионных групп аминокислот; соотношению полярных и неполярных радикалов аминокислот на поверхности молекул; степени устойчивости к воздействию различных денатурирующих агентов.
Растворимость белков зависит: n n n от перечисленных выше свойств белков; от состава среды, в которой растворяется белок (величины р. Н, солевого состава, температуры, наличия других органических веществ, способных взаимодействовать с белком). Величина заряда белков — один из факторов, увеличивающий их растворимость. При потере заряда в изоэлектрической точке белки легче агрегируют и выпадают в осадок. Это особенно характерно для денатурированных белков, у которых на поверхности появляются гидрофобные радикалы аминокислот.
Изоэлектрическая точка n Значение р. Н, при котором белок имеет суммарный нулевой заряд, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ).
Стадии выделения и очистки индивидуальных белков: n n n n n Разрушение клеток изучаемой ткани и получение гомогената. Разделение гомогената на фракции. Избирательная тепловая денатурация Высаливание. Гель-фильтрация Ультрацентрифугирование Электрофорез Ионообменная хроматография Аффинная хроматография. Для удаления низкомолекулярных соединений из раствора выделяемого белка применяют диализ
