БАЗОВЫЕ МЕТОДЫ 1. Стандартный подсчет колоний: • Готовые микробиологические подложки Rida Count Внесение раствора пробы Взятие пробы с поверхности 72 Результат анализа 1
72 2
БАЗОВЫЕ МЕТОДЫ 2 Метод подсчета наиболее вероятного числа (НВЧ): Три серии разведений или аликвот вносят в 9 или 15 пробирок соответствующей среды Численность подсчитывают с помощью стандартных таблиц НВЧ Результат, как правило, выше, чем при стандартном подсчете колоний 72 3
Базовые методы 2 НВЧ: Преимущества: Относительная простота Хорошая сопоставимость при межлабораторных сличениях Возможность определять группы микроорганизмов Приемлемость для определения фекальных колиформ Недостаток: Необходимость в большом количестве посуды Невозможность наблюдать морфологию колоний Неточность 72 4
Базовые методы 3 Использование техники восстановления красителей: Обычно использую 2 красителя: Метилен голубой (синий) Резазурин Подготовленный супернатант из пищевого продукта добавляют к стандартному раствору того или иного красителя: Исчезновение синего цвета – метиленовый синий Переход от серо-голубого (синего) к розовому или белому цвету – резазурин 72 5
Базовые методы 4 Прямой микроскопический подсчет: Готовят мазок экземпляра пищевого продукта на предметное стекло микроскопа, окрашивание и просмотр и подсчет микроорганизмов под микроскопом Преимущества: Быстрота Типовой Допускает использование флуоресцентных методов для повышения эффективности 72 6
Базовые методы 4 Прямой микроскопический подсчет: Недостаток: Утомителен аналитику Неселективен в отношении жизнеспособных микроорганизмов, частицы продукта можно спутать с клетками, клетки распределяются неравномерно, могут плохо окрашиваться Результаты, как правило, выше, чем результаты подсчета колоний 72 7
БАЗОВЫЕ МЕТОДЫ 4. Прямой микроскопический подсчет: – Темнопольная микроскопия 72 Результат анализа 8
БАЗОВЫЕ МЕТОДЫ 4. Прямой микроскопический подсчет: – Фазово-контрастная микроскопия 72 9
Физические методы Биосенсоры Измерение сопротивления Микрокалориметрия Проточная цитометрия Анализ при помощи установки Bio. Sys 72 10
Первым биосенсором в мире была обыкновенная канарейка • В XIX веке шахтёры использовали её для обнаружения утечек газа: птица теряла сознание при меньшей концентрации ядовитого вещества, чем человек, и у людей оставалось время, чтобы покинуть шахту • Сегодня разрабатывается много биосенсоров на основе культур светящихся бактерий: они реагируют на низкие концентрации токсичных веществ в воде, и по изменению уровня их свечения можно определять загрязнение задолго до того, как оно станет опасным для других живых существ 72 11
Физические методы 1 Биосенсоры Устройство или метод, позволяющий установить наличие или активность микроорганизма, живого или убитого К биосенсорам не относятся биохимические и иммунологические методы, основанные на реакции фермента с субстратом и АТ и АГ, хотя они м. б. составными частями биосенсоров Виды: Пьезоэлектрические кристаллы (акустические биосенсоры) Оптоволоконные биосенсоры 72 12
72 13
Физические методы 1 Биосенсоры Пьезоэлектрические кристаллы (акустические биосенсоры): Пьезоэлектричество – возникновение электрического тока в результате механического давления на кристалл какого-либо вещества (кварц) Вибрирующий кристалл кварца чувствителен к изменению массы – очень На кристалл кварца наносят АТ, а затем на него же наносят АГ АГ связывается с АТ и происходит увеличение массы кристалла, который меняет свою частоту вибрации Пороговая чувствительность – 1000 продолжительность ответа – 25 -40 мин 72 – 2100000 КОЕ/мл, 14
Физические методы 1 Биосенсоры Оптоволоконные биосенсоры: Оптическое волокно – волновод, выполненный из стекла или полимеров, проводящий свет за счет полного внутреннего отражения Используют оптический или электронный преобразователь для улавливания биологической реакции и преобразования ее в различимый оптический сигнал Типичный биосенсор – клиновидный оптоволоконный зонд, покрытый антителами Свет полупроводникового лазера проходит через всю систему оптических волокон и выходит на ее конце в виде исчезающей волны 72 15
Оптоволоконные биосенсеры Антитела связываются с флуоресцентно меченым антигеном, исчезающая волна взаимодействует с ним, испуская флуоресцентный сигнал во всех направлениях, который улавливается сенсорной системой Флуоресцентная метка - флуоресцентный краситель Су5 Используют для выявления E. coli 0157: Н 7, L. monocytogenes, S. typhimurium, стафилококкового энторотоксина 72 16
72 17
Физические методы 2 Измерение сопротивления Впервые было предложено в 1899 г. , но до 70 -х годов прошлого века не было ни одной действующей методики Основана на способности микроорганизмов в процессе роста расщеплять соединения с низкой электропроводностью и производить соединения с высокой электропроводностью, повышая тем самым общую электропроводность среды 72 18
Физические методы 2 Измерение сопротивления Метод обладает чувствительностью порядка 10 -100 клеток При количестве клеток 10000 -100000 /мл их присутствие обнаруживают через 5 -7 ч 72 19
ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 2. Измерение сопротивления: Микробиологический экспресс-анализатор Bac. Trac 4300 (Бак-Трак) 72 20
ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Примеры цветовой оценки образца Экспресс - анализатор Бак. Трак Отображение результатов измерений 72 21
ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 2. Измерение сопротивления: Бактометр «ТЕМПО» 72 22
Идентификация Психрофильные микроорганизмы Сальмонеллы Термофильные микроорганизмы Листерии Грамотрицательные бактерии Стафилококки Энтеробактерии Бактерии, вызывающие порчу пива Энтерококки Клостридии Лактобациллы Аэробные спорообразующие бактерии Колиформы Bacillus cereus E. coli 72 Дрожжи и плесени 23
Физические методы 2 Измерение сопротивления: Область применения: Количественная оценка степени микробного загрязнения Экспрессное определение санитарно-значимых микроорганизмов Скрининг патогенных микроорганизмов Сертификация пищевых продуктов и питьевой воды Контроль стерильности материалов и растворов Исследование активности стартовых культур Изучение влияния различных факторов на рост микроорганизмов Определение ингибирующих веществ Мониторинг окружающей среды 72 24
Физические методы 2 Измерение сопротивления: Преимущества Автоматическая регистрация и обработка результатов Сокращение времени исследования Простая подготовка образцов к исследованию Снижение затрат рабочего времени и материалов Высокая производительность системы Документация результатов 72 25
ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 2. Измерение сопротивления: • Модульный принцип построения приборов дает возможность любой лаборатории работать методом экспрессного бактериологического тестирования образцов уже при минимальной конфигурации анализатора – центральный блок обработки данных (компьютер) и один инкубаторный блок, дополнительные ячейки. • Бактериологический анализатор позволяет легко выбирать рабочую температуру в диапазоне от +3 до +50°С, обеспечивая тем самым максимально возможную широту бактериологических исследований. 72 26
Физические методы 3 Микрокалориметрия: Основан на измерении энтальпии среды, которая изменяется вследствие метаболической активности растущих в ней микроорганизмов (производство тепла тесно связано с физиологической активностью клеток) Два типа микрокалориметров: Дискретные Проточные 72 27
Физические методы 3 Микрокалориметрия Метод используется для идентификации микроорганизмов, т. к. результаты микрокалориметрии зависят от микроорганизма, размера инокулята, субстратов и большого числа параметров По виду термограмм можно различать разные виды микроорганизмов Также используется для определения жизнеспособности восстановленных замороженных клеток 72 28
Физические методы 4 Проточная цитометрия: Для изучения дрожжевых клеток Для обнаружения живых клеток Сенсоры определяют траектории и скорости движения клеток, люминесценцию и коэффициенты поглощения и преломления света, т. е. клетки можно рассортировывать 72 29
Физические методы 5 Анализ при помощи установки Bio. Sys: Производит автоматический учет и анализ изменения цвета в сосудах со средой, меняющей цвет при росте бактерий Использовали для выявления естественным образом контаминированных сальмонеллой и листерией пищевых продуктов Прозрачность среды изменялась из-за выработки сальмонеллами сероводорода Продолжительность анализа – до 24 ч. 72 30
Химические методы Используют для идентификации и определения количества микроорганизмов и продуктов их метаболизма • Определение термостабильной нуклеазы (S. aureus) • Измерение количества АТФ для живых клеток; • Радиометрия • Использование хромогенных или флуорогенных субстратов (определение или разделение микроорганизмов по видам или штаммам) • Другие 72 31
Химические методы 1 Измерение количества АТФ для живых клеток: Большинство метаболитов микроорганизмов являются особенностью отдельных их видов АТФ (аденозинтрифосфат) и ФМН (флавинмононуклеотид) – содержатся в достаточно большом количестве во всех микробных клетках 72 32
НЕКОТОРЫЕ МЕТАБОЛИТЫ Биологический объект Типичный диапазон концентраций, мкг/мг сухого веса АТФ Клетки млекопитающих Бактерии Одноклеточные водоросли ФМН гемин 0, 5 -5, 0 0, 005 -0, 05 Изменяется в широких пределах 1 -10 0, 01 -0, 20 0, 005 -5* 0, 5 -5, 0 Не известно Изменяется в широких пределах 72 33
Химические методы 1 Измерение количества АТФ для живых клеток: Возможные колебания содержания АТФ в живых клетках – не более 10 раз, поэтому достоверность количественной оценки для практических целей вполне достаточная После гибели клеток содержание АТФ резко падает в течение нескольких секунд, т. е. тест по АТФ – тест на живые клетки 72 34
ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ I. Измерение количества АТФ: экстрагирующий биолюминесцентный агент клетка реагент АТФ свет Экстрагирующий агент: 1)Максимально полно извлекать АТФ из клеток; 2)Не разрушать АТФ; 3)Минимально ингибировать биолюминесцентную реакцию. 72 35
Химические методы 1 Измерение количества АТФ: Эмиссия видимого света живыми организмами. Характерное отличие от хемилюминесценции – участие в процессе преобразования энергии специфических ферментов – люцифераз, обеспечивающих крайне высокий энергетический выход реакции Отличительная особенность монооксидазной реакции, катализируемой люциферазой – она протекает с образованием интенсивной люминесценции в сине-зеленой области спектра (~490 нм) На каждую молекулу прореагировавшего субстрата (АТФ или ФМНН 2) образуется от 0, 3 до 1, 0 квант света 72 36
Принципы ATФ исследований – биолюминесценция жука светляка Кривая сравнения ATф Люциферин + O 2 + ATФ Люцифераза Биолюминесценция 106 (RLU) 105 Mg 2+ 104 AMФ+ Оксилюциферин+CO 2+PPi 103 + 102 Свет 101 10 -17 10 -16 10 -15 10 -14 10 -13 10 -12 ATФ (моль/ оценка) 72 37
ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ I. Измерение количества АТФ: • Другая важная особенность люциферазных реакций – абсолютная специфичность по отношению к нуклеотиду, поэтому предварительно разделять сложные смеси нет необходимости. • Обеспечивает не только оценку суммарной микробиологической контаминации, но позволяет осуществлять контроль пищевых остатков. • Результаты на дисплее люминометра показываются условными единицами света (англ. RLU – relative light units). • 1 RLU равен 1 фемтомолю АТФ. 1 фемтомоль = 10 -15 моль 72 38
ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Люминометр system. SURE II и одноразовый пробоотборник Ultrasnap 72 39
ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ …дней Традиционный метод с чашками Оценка только. . . сек. метод ATФ Проверка 72 40
Биологические методы Иммунологические Молекулярно-генетические Методы фингерпринтинга 72 41
Иммунологические методы: Серотипирование (определение присутствия грам «-» микроорганизмов (эшерихии и сальмонеллы) и грам «+» (листерии) Иммунолюминесценция (АТ к известному антигену флуоресцентно метят, после обработки препарата такими мечеными антителами метку можно увидеть в УФ-свете. Данный метод стал использоваться редко из-за разработки новых более чувствительных методов) Радиоиммунологический анализ (заключается в радиоактивном мечении антигенов, которые затем взаимодействуют с антителами, затем измеряют количество связавшихся антигенов при помощи счетчика Гейгера) 72 42
Иммунологические методы Твердофазный иммуноферментный анализ -ИФА (вместо радиоактивной метки присутствует фермент, связанный с АГ и А Твердый носитель (полистирол), покрытый антигеном инкубируется с антисывороткой АТ отмываются и препарат обрабатывается Ig, связанными с ферментами, потом снова мягкая отмывка и определение количества фермента, не связавшегося с первичными антителами иммуноглобулина Применяется для определения микроорганизмов и продуктов их метаболизма: сальмонелл, стафилококков и энтеротоксинов, плесневых грибов и микотоксинов, ботулотоксинов, энтеротоксинов кишечной палочки) 72 43
Иммунологические методы Диффузия через гель (для определения количества бактериальных токсинов и энтеротоксинов. Чувствительность метода – до 0, 1 -0, 01 мкг/мл, продолжительность инкубации может быть около 6 сут. ). Гемаглютинация (используют для определения энтеротоксинов с эритроцитами овцы) 72 44
Молекулярно-генетические методы Для видовой идентификации бактерий по 16 S-РНК Метод полинуклеотидных зондов (ДНК-зондов) Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Lux-люминесценция (для морских бактерий) 72 45
Методы фингерпринтинга (обзорная хроматограмма, пептидная карта) Фаготипирование (для ограниченного числа видов – L. monocytogenes, S. aureus, E. coli, B. cereus) Рестрикционный анализ Гель-электрофорез в пульсирующем поле Анализ с помощью микроматриц 72 46
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ • Методы фингерпринтинга (обзорная хроматограмма, пептидная карта): – Фаготипирование (для ограниченного числа видов – L. monocytogenes, S. aureus, E. coli, B. cereus) – Рестрикционный анализ – Гель-электрофорез в пульсирующем поле – Анализ с помощью микроматриц 72 47
Выводы 1. В зависимости от поставленной задачи микробиолог может использовать как один метод, так и их сочетание. 2. На пищевых предприятиях чаще всего используют базовые методы (они стандартизированы) с разрешенными (зарегистрированными в установленном порядке) усовершенствованиями. 3. Методы постоянно развиваются и модифицируются. 4. Основная цель этих усовершенствований – повышение чувствительности, точности и воспроизводимости метода контроля. 72 48
Скачать презентацию БАЗОВЫЕ МЕТОДЫ 1 Стандартный подсчет колоний Готовые
методы санитарной микробиологии2.pptx