Бактериофаги — вирусы бактерий СПб ГУ 2011

Бактериофаги - вирусы бактерий СПб. ГУ 2011

Вопросы n 1. Актуальность проблемы n 2. Фаги - определение и терминология. История открытия n n n n n фагов 3. Строение фагов 4. Стратегия поведения фагов 5. Жизненный цикл вирулентных фагов 6. Жизненный цикл умеренных фагов 7. Вирусная конверсия 8. Классификация фагов 9. Нитевидные фаги 10. Полиэдрические фаги 11. Профилактика и терапия лечебными бактериофагами.

1 вопрос. Актуальность проблемы Повышенный интерес к бактериофагам n Ведущую роль в этиологии гнойно- воспалительных заболеваний играют лекарственноустойчивые (резистентные) штаммы условно-патогенных бактерий. n Применение АМП может быть мало эффективным, сопровождаться нарушениями нормальной микрофлоры и вести к формированию резистентных штаммов бактерий, а также иммунодефицитных состояний и аллергизации макроорганизма.

Активизация патогенных свойств условно-патогенных бактерий (УПБ) – микробиоты проявляется: n Колонизация слизистых оболочек с n n n образованием биопленок и развитием гнойносептических состояний. Стимуляция образования медиаторов воспаления. Повреждение тканей: гипоксия, нарушение микроциркуляции и свертываемости крови. Формирование лекарственноустойчивых штаммов УПБ. Аллергические проявления. Рецидивирующее течение и хронизация процесса.

КРИТЕРИИ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ УПБ при гнойно-воспалительных заболеваниях n Высокий популяционный уровень УПБ и способность к формированию биопленок. n Наличие фенотипических и генетических маркеров вирулентности, ответственных за адгезивную, колонизирующую, цитотоксическую активность и способность к размножению in vivo.

Преимущества лечебных бактериофагов при сравнении с АМП - Поражение как чувствительных, так и лекарственноустойчивых клеток возбудителей заболеваний. - Каскадная способность к повторному избирательному лизису остающихся в очаге воспаления бактерий до полной их элиминации из очага воспаления. - Участие в восстановлении нормальной микрофлоры (микробиоценоза).

ОСОБЕННОСТИ ЛЕЧЕБНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ Высокая специфичность к бактериальным клеткам-мишеням Хорошая совместимость с другими лекарственными средствами при терапии кишечных, респираторных и урогенитальных инфекций у детей и взрослых. n Противопоказаний к приему бактериофагов не существует.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФАГОТЕРАПИИ n Циклы репродукции специфических бактериофагов с их накоплением в зоне локализации воспалительного процесса важная особенность фаготерапии, отличающая ее от действия этиотропных химиотерапевтических препаратов, часто нарушающих нормальную микрофлору организма хозяина.

2 вопрос. Фаги - определение и терминология Сокращенно "Фаги"- вирусы бактерий Облигатные паразиты на молекулярном уровне Нападают на своих хозяев-бактерий Вне бактериальной клетки - не активны Полностью зависят от жизнедеятельности бактерий и существуют за их счет: n для репликации генома и образования новых фагов используют белки и ферменты бактерий. n высвобождение фагов сопровождается гибелью клеток-хозяев. n n n

История открытия фагов n Феликс д’Эррель открыл бактериофаги в 1917 г. n Наблюдал опосредованно, изучая лизис бактерий

Феликс д’Эррель (1873 -1949). военный врач (Франция)

Наблюдения Ф. д’Эрреля: n Изучал возбудителей дизентерии n Выделил чистую культуру Shigella dysenteriae n Наблюдал их исчезновение n Агента, вызвавшего этот эффект назвал бактериофагом n Доказал, что наблюдал лизис бактерий S. dysenteriae фильтрующимся вирусом

Негативные колонии бактериофагов результат лизиса бактерий n. Shigella dysenteriae

Визуализация фагов n Первый электронный микроскоп n изобрели в Германии n в 1940 г. братья Руска (один – врач, другой - физик) n 1942 г. – впервые увидели фаги n Это событие послужило началом развития вирусологии

Бактериофаг Т 4 (компьютерная графика )

3 вопрос. Строение фагов определяет их характер поведения: Доставляют НК в клетку-хозяина Сами остаются вне клетки в виде "тени" "Тень" – пустая головка фага Головка содержат генетический материал: ДНК или РНК НК - линейная 2 Н, реже 1 Н Головка - чаще только белковый капсид, реже содержит мембрану от клетки-хозяина Капсид - 2 функции: защитная и адсорбция Специализированное приспособление для адсорбции отросток с базальной пластиной (может отсутствовать) n Рецепторы (нити) – специфические к определенным бактериям n n n n n

Фаг-λ E. coli

4 вопрос. Стратегия поведения фагов n Наличие специфических рецепторов определяет возможность заражения бактериальных клеток n Доставка нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина n Пустой капсид фаговой частицы ("тень") остается с внешней стороны бактериальной клетки n Стратегия поведения связана с особенностями строения бактериальной клетки и их клеточной стенки n

Инфицирование фагом Т 4 клетки E. coli K 12

Этапы инфекционного процесса n 1. Адсорбция к соответствующим бактериальным n n n рецепторам На поверхности бактерий есть рецепторы (элементы клеточной стенки), соответствующие рецепторам фага. Адсорбция: 1. обратимая (фаг отрывается) и 2. необратимая (плотное присоединение) На этом свойстве основан метод диагностики бактерий - фаготипирование Имея набор фагов, можно определить их хозяев.

Стадии адсорбции бактериофагов: приземление, прикрепление, сокращение отростка, проникновение отростка, инъекция ДНК

Адсорбция фага Т 4 и проникновение ДНК в клетку E. coli

События после адсорбции n В зависимости от свойств и стратегии поведения фаги делят на 2 группы: n 1. Вирулентные фаги – литический цикл n 2. Умеренные фаги – лизогенный цикл

Варианты развития вирусной инфекции Вирулентные фаги Умеренные фаги

5 вопрос. Жизненный цикл вирулентного фага (литический цикл) n вызывают реальную инфекцию n разрушение бактериальной клетки (литический процесс): n n n 1. адсорбция 2. проникновение НК в клетку 3. репликация НК 4. синтез новых компонентов фаговых частиц и их сборка (морфопоэз) 5. высвобождение фаговых потомков n Вирулентные фаги реплицируются только в результате литического процесса

Выход бактериофагов из лизированной бактерии

6 вопрос. Жизненный цикл умеренного фага (лизогенный процесс) n 1. Вместо синтеза новых фагов и лизиса бактерии - n n n n n репликация фаговой НК вместе с геномом клетки-хозяина лизогения При лизогении фаг называется профагом 2. Существование в клетке-хозяина в виде профага в: а) свободном состоянии (плазмидоподобном) б) интегрированном состоянии в хромосому клеткихозяина 3. Интеграция в геном клетки-хозяина происходит: в случайных участках, например фаг-μ (фаг-мю) в специфических участках, например фаг-λ (фаг-лямбда) 4. Активация профага в лизогенных бактериях 5. Образование новых фаговых частиц и лизис бактериальной клетки

Механизмы торможения литического процесса n В составе генома умеренного фага содержатся гены, n n n ответственные за образование белка-репрессора Белок-репрессор подавляет активность других генов умеренного фага, что тормозит развитие литического процесса в бактериальной клетке Именно поэтому умеренные фаги могут долгое время существовать в виде профага в клетке бактерии как плазмида или быть интегрированными в геном клеткихозяина Бактерии, содержащие фаг в виде профага, называются лизогенными В любой момент профаг может активизироваться, что приведет к лизису бактериальной культуры

Индукция литического процесса умеренных фагов n n n n n Лизис может быть запущен: УФ-облучение Действие химических веществ (метамицин С) Изменение температуры Спонтанный процесс При этом происходит: 1. Разрушение белка-репрессора 2. индукция репликации фаговой НК 3. образование фаговых частиц - реализация литического процесса

7 вопрос. Вирусная конверсия n С умеренными фагами связано явление вирусной конверсии n Изменение свойств лизогенных бактерий, содержащих профаг n Трансдукция – передача определенных признаков, напр. о выработке токсинов: n 1. Corynebacterium diphtheriae – содержат 11 умеренных фагов, 5 из них несут информацию о дифтерийном токсине n 2. род Clostridium

8 вопрос. Классификация фагов n Основана на морфологической характеристике: n Размеров n Формы вириона n Природе НК n Числе и функции белков n Наличии или отсутствии липидов (мембраны от клетки-хозяина)

Морфологические типы фагов 2 формы капсида: нитевидные и полиэдрические n I тип – нитевидные, ДНК-содержащие, n II тип – полиэдрические с аналоговым отростком (РНК или 1 Н ДНК), n III тип – полиэдрические с коротким отростком (Т 3, Т 7), n IV тип – полиэдрические с несокращающимся отростком 2 Н ДНК (Т 1, Т 5), n V тип – полиэдрические с сокращающимся отростком с базальной пластинкой (Т 2, Т 4, Т 6)

I тип - нитевидные ДНК-содержащие фаги

II тип: фаги с аналоговым отростком (РНК или 1 Н ДНК)

III тип: Фаги с коротким отростком (Т 3, Т 7)

IV тип: Фаги с несокращающимся отростком 2 Н ДНК (Т 1, Т 5)

V тип: Фаги с сокращающимся отростком с базальной пластинкой (Т 2, Т 4, Т 6)

9 вопрос. Нитевидные фаги (fd, M 13) n Содержат кольцевую 1 -цепочечную ДНК n n n хромосому Хромосома окружена белковым капсидом (оболочкой) продолговатой формы Ср. диаметр – 6 нм Ср. длина – 89 нм Капсид состоит из 1 -го белка (сотни тысяч субъединиц) Длина нитевидного капсида определяется длиной ДНК Несколько молекул специального белка, прикрепленного к одному из концов фага, формируют комплекс адсорбции

10 вопрос. Полиэдрические фаги n Сложное строение капсида: n Октаэдр (8 -гранник) n Икосаэдр (20 -гранник) n В капсиде заключена плотно упакованная ДНК n От основания капсида отходит отросток – "органелла" адсорбции n Типичный представитель – сем. Myoviridae

сем. Myoviridae Т-четный фаг Т-4 Фаги Т-серии, относятся к вирусам E. coli Состоит: из головки-капсида (диаметр 115 нм) отростка – сократительная структура из актиноподобного белка (в полосочку) (длина 100 нм) n Базальной пластинки – 6 игл, в основе шестигранник: n 100 молекул АТФ, ионы кальция, лизоцим n n n

Т-четный фаг Т-4

11 вопрос. КЛИНИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ после воздействия препаратов лечебных бактериофагов n Выделение этиологического агента n Подбор специфического высокоактивного фага (из коллекции более 250 фагов) с постоянным контролем в ходе лечения 550 человек с заменой фага при необходимости. n Положительные результаты лечения составляли от 75 до 100% случаев.

ОСТ 91 500. 11. 004 -2003 n В Отраслевом Стандарте «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (Приказ МЗ РФ № 231, 2003), внимание педиатров ориентировано на профилактику и терапию дисбиотических состояний у детей пробиотиками и специфическими лечебными бактериофагами.

ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ n Ведущими в мировой практике по разработке лекарственных форм бактериофагов в последние десятилетия были работы отечественных ученых, позволивших расширить ассортимент производственной продукции и перейти от жидких бактериофагов к таблетированным формам, а в настоящее время – к концентратам, линиментам и гелям

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ n Очищенные концентраты бактериофагов более эффективны и менее реактогенны, чем исходные жидкие формы n Для увеличения срока годности препараты лиофильно высушивают n Предпочтительнее использовать кислотоустойчивые таблетки n Более удобен линимент, приготовленный на ланолине и касторовом масле

СПОСОБЫ ПРИМЕНИЯ лечебных БАКТЕРИОФАГОВ n аппликации на месте поражения, n пероральный, n подкожный, n внутримышечный, n внутрибрюшинный способы введения, n клизмы, n аэрозоли, n (введение в полость легких, в перикард и т. д. )

МОНОВАЛЕНТНЫЕ БАКТЕРИОФАГИ n n n стафилококковый стрептококковый бактериофаг коли жидкий клебсиеллезный протейный синегнойный жидкий

Комбинированные препараты лечебных бактериофагов n Из нескольких видов бактериофагов: n коли-протейный, n пиобактериофаг (против стафилококков, стрептококков, клебсиелл, протеев, синегнойной и кишечной палочек), n интести-фаг (против шигелл, сальмонелл, стафилококков, энтерококков, протеев, кишечной и синегнойной палочек).

ВЫВОДЫ: Лечебные бактериофаги альтернатива химиотерапевтическим этиотропным препаратам (АМП) n Лечебные бактериофаги подавляют чувствительные, так антибиотикоустойчивые бактерии. как и n Рекомендовано использовать комплексные бактериофаги с высокой специфической литической активностью, способные элиминировать возбудителей без подавления индигенной нормофлоры. n Важным является идентификация и определение чувствительности возбудителя к бактериофагу с целью выбора эффективного препарата.