Бактерии продуценты в биотехнологии Общая схема

Бактерии – продуценты в биотехнологии

Общая схема строения мембран основу мембраны составляет двойной молекулярный слой липидов (липидный бислой) на котором и в толще которого находятся белки Жидко мозаичная модель строения плазматической мембраны

Разнообразие форм прокариот 1 5 — кокки; 6 — палочки; 7 — спириллы; 8 — вибрион; 9 — кольцевидные; 10 — бактерии, образующие выросты (простеки); 11 —червеобразные; 12 — в виде звезды; 13 — актиномицеты; 14 —миксобактерии; 15, 16 — нитчатые; 8, 15, 17, 18 — бактерии с разными типами жгутикования; 19 — бактерии, образующая капсулу; 20 — нитчатые бактерии, заключенные в чехол, инкрустированный гидратом окиси железа; 21 — бактерия, образующая шипы; 22 — Galionella

Окраска по Граму 1. На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1 -2 мин снять ее, а краситель слить. 2. Нанести раствор люголя на 1 -2 мин (йод) 3. Обесцветить этиловым спиртом в течении 30 -60 с. 4. Промыть водой 5. Докрасить водным раствором фуксина в течении 1 -2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.

Окраска по Граму • Грамположительные бактерии хорошо удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом и устойчивы к обесцвечиванию спиртом. После обработки фуксином они окрашиваются в фиолетово-пурпурный цвет. • Грамотрицательные бактерии обесцвечиваются спиртом, то есть теряют комплекс генцианового фиолетового с йодом, и хорошо поглощают фуксин. Б мазках они окрашиваются в малиново. Окраска по Граму Staphylococcus красный цвет. aureus (грамположительные кокки) и Escherichia coli (грамотрицательные палочки)

Строение клеточной стенки грамположительных (А) и грамотрицательных бактерий (Б) 1 цитоплазматическая мембрана, 2 – пептидогликан, 3 – периплазматическое пространство, 4 – наружная мембрана, 5 – цитоплазма (в центре ДНК)

Строение клеточной стенки бактерий Б А А – грамположительные бактерии Б – грамотрицательные бактерии 4 3 1 22

Муреин пептидогликан бактериальных клеточных стенок представляет собой дисахарид из N ацетилглюкозамина и N ацетилмурамовой кислоты, к которому присоединена тетрапептидная боковая цепь из L аланина, D глутаминовой кислоты, L лизина и D аланина. Тетрапептидные боковые связи всех дисахаридных единиц связаны с соседними цепями при помощи поперечных пентапептидных мостиков из глицина.

Основные типы жгутикования и движения бактерий Бактерии со жгутиками двигаются очень быстро: Bacillus megaterium – 1, 6 мм/мин, Vibrio cholerae – 12 мм/мин

Спорообразование (споруляция) 1 – цитоплазма, 2 – плазматическая мембрана, 3 – клеточная стенка зародыша, 4 – кора споры, 5 – внутренняя оболочка споры, 6 – наружная оболочка споры, 7 – экзоспориум.

«Руководство по определению бактерий Берджи» (D. H. Bergey, I 860 — 1937) Таксономические признаки бактерий: морфологические признаки: форма клеток (кокки, палочки или спириллами), наличие капсулы, наличие агрегатов клеток (нити, тетрады, пакеты), наличие жгутиков и их расположение, образование эндоспор, особенности внутриклеточного строения, окрашивание по Граму (окрашивание, основанное на способности воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового с йодом либо терять его после обработки этанолом). культуральные признаки (признаки, выявляемые при культивировании в лаборатории чистой культуры).

Таксономические признаки бактерий: Физиолого-биохимические признаки: 1) отношение к кислороду, т. е. растут ли клетки в аэробных или в анаэробных условиях, либо в тех и других; 2) каким образом они получают необходимую энергию в процессе дыхания, брожения или фотосинтеза; 3) зависимость роста от температуры и р. Н, с указанием оптимума и пределов устойчивости; 4) усваиваемые клетками питательные вещества; 5) места обитания; 6) наличие симбиотических или паразитических взаимоотношений; 7) клеточные включения, пигментация и состав капсулы; 8) компоненты клеточной стенки (пептидогликановый остов, липополисахариды, тейхоевая'кислота); 9) серологическая дифференциация (поверхностные антигены, гомологичные бел ки); 10) состав оснований ДНК (мол. % GC); 11) гибридизация ДНК/ДНК, трансформируемость при межвидовом переносе ДНК; 12) последовательность нуклеотидов в 16 S или 5 S р. РНК; 13) чувствительность к антибиотикам.

«Руководство по определению бактерий Берджи» , 9 -е издание Группа 1. Спирохеты. Включает свободноживущие и паразитические виды; Группа 2. Аэробные и микроаэрофильные подвижные извитые и изогнутые грамотрицательные бактерии. Группа 3. Неподвижные (редко подвижные) грамотрицательные бактерии. Группа 4. Грамотрицательные аэробные и микроаэрофильные палочки и кокки. Группа 5. Факультативно анаэробные грамотрицательные палочки. Группа 6. Грамотрицательные анаэробные прямые, изогнутые и спиральные бактерии. Группа 7. Бактерии, осуществляющие диссимиляционное восстановление сульфата или серы. Группа 8. Анаэробные грамотрицательные кокки. Группа 9. Риккетсии и хламидии. Группы 10 и 11. Анокси и оксигенные фототрофные бактерии. Группа 12. Аэробные хемолитотрофные бактерии и родственные организмы. Объединяет серо железо и марганецокисляющие и нитрифицирующие бактерии. Группы 13 и 14. Почкующиеся и/или обладающие выростами бактерии образующие футляры. Группы 15 и 16. Скользящие бактерии, не образующие плодовые тела и образующие их. Группа 17. Грамположительные кокки. Группа 18. Спорообразующие грамположительные палочки и кокки. Группа 19. Споронеобразующие грамположительные палочки правильной формы. Группа 20. Споронеобразующие грамположительные палочки неправильной формы. Группа 21. Микобактерии. Группы 22 -29. Актиномицеты. Группа 30. Микоплазмы. Остальные группы определителя Берджи — метаногенные бактерии (31), сульфатредуцируюшие бактерии (32 экстремально галофильные аэробные архебактерии (33), архебактерии, лишённые клеточно стенки (34), экстремальные термофилы и гипертермофилы, метаболизируюшие серу (35).

Классификация на основе различий в строении клеточной стенки

Патогенные бактерии Туберкулез вызывается бактериями рода Mycobacterium.

Патогенные бактерии Clostridium tetani благодаря способности образовывать эндоспоры могут длительное время выживать в неблагоприятных условиях. Попадая с почвой в кровь, вызывают газовую гангрену.

Патогенные бактерии. Гастрит и язвенная болезнь, связаны с развитием бактерии Helicobacter pylori

Механизм распределения бактериальных хромосом А – клетка содержит частично реплицированную хромосому, прикрепленную к ЦМ в точке репликации; Б – репликация хромосомы завершена; В – разделение дочерних хромосом. 1 – ДНК; 2 – прикрепление хромосомы к ЦМ; 3 – ЦМ; 4 – клеточная стенка; 5 – синтезированный участок ЦМ; 6 – новый материал клеточной стенки.

Размножение бактерий бинарным делением

Кинетика роста микрорганизмов Фазы роста бактерий в периодической культуре I лаг фаза, II – логарифмическая фаза, III фаза замедленного роста, IV – стационарая фаза, V – фаза отмирания. Х – концентрация клеток, 106 кл/мл

Определение ростовых параметров В логарифмической фазе скорость роста микроорганизмов прямо пропорциональна их концентрации где – концентрация бактерий (клеток/мл или г биомассы/мл); удельная скорость роста, ч 1; t – время культивирования. Удельная скорость роста После интегрирования где ХО – начальная концентрация бактерий (клеток/мл или г биомассы/мл); Время удвоения популяции (время генерации) Средняя продуктивность биотехнологического процесса

Время генерации Бактерии Среда Escherichia coli Bacillus megaterium Streptococcus lactis Staphylococcus aureus Lactobacillus acidophilus Glucose salts Sucrose salts Milk Lactose broth Heart infusion broth Время генерации (мин) 17 25 26 48 27 30 Milk 66 87 Rhizobium japonicum Mycobacterium tuberculosis Treponema pallidum Mannitol salts yeast 344 461 extract Synthetic 792 932 Rabbit testes 1980

Рост в непрерывной культуре

Факторы, влияющие на рост бактерий • Температура • p. H • Кислород Группы прокариот в зависимости от отношения к молекулярному кислороду

Влияние температуры на рост бактерий

Температурные границы и оптимальные температуры роста прокариот I. III. Психрофилы: 1 – облигатные; 2 – факультативные. II. Мезофилы. III. Термофилы: 3 – термотолерантные; 4 – факультативные; 5 – облигатные; 6 – экстремальные. Жирной линией выделены оптимальные температуры роста.

Температурные оптимумы роста бактерий

Границы и и оптимальные зоны роста прокариот в зависимости от р. Н 1 – нейтрофилы; 2, 3 – кислотоустойчивые и щелочеустойчивые прокариоты соответственно; 4 – ацидофилы; 5 – алкалофилы; А и Б – облигатные и факультативные формы соответственно.

Бактерии – продуценты важнейших продуктов Бактерии Субстрат, источник углерода Продукты Аэробные бактерии Acetobacter aceti Этанол, уксусная кислота Уксусная кислота Gluconobacter oxydans 1. Глицерин 2. D-сорбит 1. Диоксиацетон 2. L-сорбоза Corynebacterium glutamicum Сахароза (меласса) L-глутаминовая кислота L-лизин Streptomyces griseus Глюкоза, соевая мука Стрептомицин Streptomyces aureofciencs Сахароза Тетрациклин Bacillus subtilis Крахмал или кукурузная мука Амилолитические ферменты Xanthomonas campestris Меласса, гидролизаты крахмала Экзополисахарид ксантан Micobacterium globiform Глюкоза Биотрансформация гидрокортизона в преднизолон Alcaligenes eutrophus Диоксид углерода Поли-3 -гидроксибутират, биоразлагаемый полимер Zoogloea rumigera, нитчатые бактерии, тионовые бактерии, псевдомонады Органические вещества Биологическая очистка сточных вод

Бактерии – продуценты важнейших продуктов Бактерии Субстрат, источник углерода Продукты Факультативные анаэробные бактерии Lactobacillus bulgaricus Сахароза L-молочная кислота (меласса), гидролизаты крахмала Генномодифицированные штаммы Escherichia coli Глюкоза Инсулин Соматотропин Propionbacterium freudenreichii Propionbacterium shermanii Гидролизаты казеина, пептоны Витамин В 12 Анаэробные бактерии Clostridium acetobuthylicum Меласса, Ацетон, бутанол гидролизаты крахмала, мука Methanococcus, Methanosarcina, Methanobacterium Низшие жирные кислоты Биогаз (метан+диоксид углерода)

ЭУКАРИОТЫ

Внутреннее строение эукариотической клетки животного (А) и растения (Б) 1 ядро, содержащее хроматин и ядрышко, 2 плазматическая мембрана, 3 плотная клеточная оболочка, 4 плазмодесмы, 5 гранулярная эндоплазматическая сеть (с прикрепленными к ней "эукариотическими" рибосомами), 6 гладкая (агранулярная) эндоплазматическая сеть, 7 пиноцитозные вакуоли, 8 аппарат Гольджи, 9 лизосомы, 10 включения жира, 11 центриоль и микротрубочки, 12 митохондрии, 13 полирибосомы, 14 вакуоли, 15 хлоропласты.

Строение типичной клетки животного 1. Ядрышко 2. Ядро 3. Рибосома 4. Везикула 5. Шероховатый эндоплазматический ретикулум 6. Аппарат Гольджи 7. Клеточная стенка 8. Гладкий эндоплазматический ретикулум 9. Митохондрия 10. Вакуоль 11. Гиалоплазма 12. Лизосома 13. Центросома (Центриоль) Эндоплазматический ретикулум состоит из разветвлённой сети трубочек и карманов, окружённых мембраной. Функции – синтез и транспорт белков, липидов и др. Основной функцией ядрышка является синтез рибосом. Митохондрии – важнейшие органеллы, в которых осуществляется окисление органических веществ до диоксида углерода и воды и аккумулирование выделяющейся энергии в виде АТФ. Аппарат Гольджи (комплекс Гольджи) — мембранная структура эукариотической клетки, органелла, в основном предназначенная для выведения веществ, синтезированных в эндоплазматическом ретикулуме.

Строение эукариотической клетки Компартментализация – выраженное подразделение цитоплазмы на множество обособленных пространств

Строение эукариотической клетки

Схема синтеза рибосом в клетках эукариот 1. Синтез м. РНК рибосомных белков РНК полимеразой II. 2. Экспорт м. РНК из ядра. 3. Узнавание м. РНК рибосомой и 4. синтез рибосомных белков. 5. Синтез предшественника р. РНК (45 S — предшественник) РНК полимеразой I. 6. Синтез 5 S p. РНК полимеразой III. 7. Сборка большой рибонуклеопротеидной частицы, включающей 45 Sпредшественник, импортированные из цитоплазмы рибосомные белки, а также специальные ядрышковые белки и РНК, принимающие участие в созревании рибосомных субчастиц. 8. Присоединение 5 S р. РНК, нарезание предшественника и отделение малой рибосомной субчастицы. 9. Дозревание большой субчастицы, высвобождение ядрышковых белков и РНК. 10. Выход рибосомных субчастиц из ядра. 11. Вовлечение их в трансляцию Термин «рибосома» был предложен Ричардом Робертсом в 1958. Нобелевская премия по химии 2009 года получена за определение структуры прокариотической рибосомы учёным из Великобритании Венкатраманом Рамакришнаном, американцем Томасом Стейцем и израильтянкой Адой Йонат.

Молекулярная характеристика рибосом В состав эукариотической рибосомы входят четыре молекулы РНК разной длины: 28 S РНК содержит 5000 нуклеотидов, 18 S РНК - 2000, 5, 8 S РНК - 160, 5 S РНК - 120. Рибосомные РНК обладают сложной вторичной и третичной структурой, образуя сложные петли и шпильки на комплементарных участках, что приводит к самоупаковке, самоорганизации этих молекул в сложное по форме тело. Сведберга Единица единица измерения коэффициента седиментации, являющегося мерой массы макромолекул. Его находят, измеряя скорость осаждения молекул в центробежном поле. Названа в честь шведского физико-химика Т. Сведберга (1884– 1971), разработавшего метод ультрацентрифугирования, сконструировавшего первую ультрацентрифугу и применившего ее (1925) для определения мол. массы белков.

Определение массы биомолекул методом ультрацентрифугирования (седиментационный анализ) где R – газовая постоянная, эрг/(моль • град); Т – абсолютная температура (по шкале Кельвина); s – константа седиментации (зависит как от массы, так и от формы молекулы); ρ – плотность растворителя; v – парциальный удельный объем молекулы; D - коэффициент диффузии. Единица измерения отношения скорости седиментации к центробежному ускорению - сведберг. 1 сведберг = 10 -13 сек. Обозначается большой латинской буквой S. где v – скорость перемещения границы растворительвещество, см/с; ω – угловая скорость ротора, рад/с; r – расстояние от центра ротора до середины ячейки

ГРИБЫ Грибы относятся к царству Fungi (Mycetes, Mycota). Это многоклеточные или одноклеточные нефотосинтезирующие эукариотические микроорганизмы с клеточной стенкой. Грибы имеют ядро с ядерной оболочкой, цитоплазму с органеллами, цитоплазматическую мембрану и многослойную, ригидную клеточную стенку, состоящую из нескольких типов полисахаридов, а также белка, липидов и др. Цитоплазматическая мембрана содержит гликопротеины, фосфолипиды и эргостеролы. Формы грибов - гифальные (плесневые) и дрожжевые. Размножение грибов происходит половым и бесполым (вегетативным) способами.

Мицеллиальные грибы Вегетативные гифы грибов А –у фикомицетов гифы несептированные(не имеют поперечных перегородок); Б – септированные гифы эумицетов; В – у оомицетов гифы разделены неполными перетяжками.

ДРОЖЖИ Внетаксономическая группа одноклеточных грибов, утративших мицеллиальное строение в связи с переходом к обитанию в жидких и полужидких, богатых органическими веществами субстратах. Дрожжи могут получают энергию за счет процессов брожения, выделяя при этом значительные количества спирта, органических кислот и других веществ. Брожение дрожжей используют в хлебопечении, приготовлении вина и кумыса с древнейших времен. Дрожжи Saccharomyces cerevisae и Pichia pastoris успешно применяют в качестве систем экспрессии эукариотических белков в генетической инженерии.

Строение дрожжевой клетки Кст – клеточная стенка; Мит – митохондрия; Ж – жировая капелька; ПМ – плазматическая мембрана; Яш – ядрышко; ЭР – эндоплазматический ретикулум; П – гранулы полифосфата. Д – диктиосомы, одна из форм аппарата Гольджи.

Yarrowia lipolytica • 1 - почкующиеся клетки, 2 - псевдомицелий, 3 - аски с аскоспорами

БИОТЕХНОЛОГИЯ ГРИБОВ Грибы используют для получения: • этанола (Saccharomyces cerevisiae); • органических кислот (Aspergillus niger); • антибиотиков (пенициллы, цефалоспорины); • каротиноидов (астаксантин, придающий мякоти лососевых рыб красно оранжевый оттенок вырабатывают Rhaffia rhodozima, которых добавляют в корм на рыбозаводах); • Кормового белка (Candida, Saccharomyces lipolitica); • сыров типа рокфор и камамбер (пенициллы); • соевого соуса (Aspergillus oryzae).

Сравнение прокариотов и эукариотов Прокариоты организмы Эукариоты бактерии грибы, простейшие, растения, животные размер клеток 1 -10 мкм 10 -100 мкм отношение к аэробы, анаэробы О 2 органеллы отсутствуют присутствуют ДНК кольцевая в хромосомы в ядре, есть цитоплазме, ДНК в митохондриях, плазмиды хлоропластах деление клеток бинарное митоз, мейоз клеточная организация одноклеточные многоклеточные с клеточной дифференцировкой