АВТОМАТИЗИРОВАННЫЙ АНАЛИЗ ИЗОБРАЖЕНИЙ ДЛЯ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ Раздел 2 УСТРОЙСТВО И ПРИНЦИП РАБОТЫ АНАЛИЗАТОРА ИЗОБРАЖЕНИЙ ДЛЯ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ
Анализатор изображений (АИ) представляет собой программноаппаратный комплекс, предназначенный для получения, преобразования, количественной обработки изображений и хранения полученной информации. Работает с микрообъектами в световой области 360 -770 нм (область видимого света). Состоит из системы ввода изображений (микроскоп, камера), компьютера (ПК) и программного обеспечения.
Оборудование кафедры ТОи. ФМ Olympus GX 51 с программным пакетом анализа изображений SIAMS 700 Оптические микроскопы Nikon Epiphot 200
Программное обеспечение, входящее в состав АИ, определяет технологию его работы. В зависимости от специализации анализатора набор имеющихся функций ПО может сильно варьироваться, но в общем виде включает в себя семь основных блоков • • блок ввода данных (ввод кадров и серий кадров, регистрация входных данных); блок редактирования и преобразований (редактирование, изменение яркости, контрастности, морфологические операции, арифметические операции, специальные фильтры и т. д. ); блок распознавания (нахождение анализируемых объектов на изображении); блок измерений (измерения в интерактивном и автоматическом режиме, классификация объектов, статистическая обработка и т. д. ); блок вывода результатов (вывод результатов обработки, печать бланка заключения, обмен с базой данных, взаимодействие с другими программами, запись изображений на диск и т. д. ); блок конфигурирования программы (настройка функциональных клавиш, создание алгоритмов, установка начальных параметров работы программы и т. д. ); система подсказок и справочной информации.
Световые микроскопы Микроскоп (от лат. micros — малый и scopein — рассматривать, наблюдать) — прибор, позволяющий наблюдать увеличенное изображение объектов и структур. Световая микроскопия основывается на законах геометрической оптики и волновой теории образования изображения. Ниже представлены основные блоки, по которым можно представить световой микроскоп любого типа. Блок-схема микроскопа
Классификация световых микроскопов В основе классификации световых микроскопов положены геометрические параметры объекта и его изображения, а также физические явления, связанные с волновой природой света, которые реализуются в конструкции микроскопа. Световые микроскопы делятся на микроскопы плоского поля (двухмерное изображение объекта) и стереоскопические (объемное или трехмерное изображение объекта). И те, и другие, в свою очередь, подразделяются на микроскопы проходящего света и микроскопы отраженного света. С помощью микроскопов проходящего света плоского поля можно рассматривать прозрачные и полупрозрачные объекты. Традиционно, в отечественной литературе эти микроскопы называют биологическими микроскопами, несмотря на то, что они давно нашли свое применение в других областях науки и техники. Микроскопы отраженного света предназначены для исследования полупрозрачных объектов и непрозрачных объектов с различными коэффициентами отражения. Традиционно, эти микроскопы носят название «металлографические микроскопы» .
Оптический микроскоп Olympus GX 51 источник света Револьверный механизм смены объективов Предметный столик Крепление для фотокамеры Регулировка интенсивности источника света Ручка регулировки резкости
Устройство микроскопа Осветительная часть предназначена для создания равномерного светового потока, который проходит через объект (проходящий свет) или отражается от него (отраженный и падающий свет), а также для обеспечения условий точного воспроизведения объекта по цвету, форме и разрешению элементов в конечном увеличенном изображении. Осветительная часть включает: • источник света (лампа и электрический блок питания); • оптико-механическую систему, расположенную за лампой.
Оптико-механическая часть Для микроскопов проходящего света оптико-механическая часть состоит из коллектора, полевой ирисовой диаграммы, и конденсора со встроенной апертурной ирисовой диафрагмой. В микроскопах отраженного света роль конденсора играет объектив, кроме того, в осветительную систему входит полупрозрачное зеркало, отражающий осветительный поток от источника света на объект и пропускающий световой поток, формирующий изображение.
Объективы микроскопа предназначены для построения действительного микроскопического изображения с соответствующим увеличением, разрешением элементов, точностью воспроизведения по форме и цвету объекта исследования. Объектив состоит из фронтальной и последующей частей. Фронтальная линза (или система линз) обращена к препарату (объекту исследования) и является основной при построении изображения соответствующего качества, определяет рабочее расстояние и числовую апертуру объектива.
Параметры микроскопа К основным параметрам микроскопа относятся: • увеличение; • разрешающая способность; • линейное поле на предмете; • степень исправления аберраций.
Общее увеличение микроскопа зависит от увеличения объектива, окуляра, промежуточных увеличивающих систем. Общее увеличение микроскопа равно произведению значений увеличений всех оптических систем: Гм = βОБ*ГОК*q 1*q 2*… , где Гм - общее увеличение микроскопа, βОБ — увеличение объектива, ГОК увеличение окуляра, q 1, q 2 — увеличение дополнительных систем.
Апертура объектива. Угловая апертура объектива — это максимальный угол, под которым лучи, идущие от препарата могут попадать в объектив. Числовая апертура объектива (А) — произведение синуса половины угловой апертуры на показатель преломления среды между предметом и фронтальной линзой объектива. А= n sin u/2 где n — показатель преломления среды, между объектом наблюдения и объективом, u — апертурный угол. Числовая апертура определяет ряд важнейших свойств микроскопа: яркость изображения, «проникающую» способность (глубину резкого видения) и «отображающую» способность, т. е. степень сходства изображения с предметом (разрешающая способность). Увеличение числовой апертуры повышает способность объектива воспроизводить мелкие детали объекта. Кроме этого, числовая апертура «управляет» условиями наблюдения: освещенностью в плоскости предмета (принцип Келера) и полезным увеличением.
F – фокусное расстояние; L – плоскость линзы (объектива); d – предельное разрешение; H – ГРИП (глубина резко изображаемого пространства). Апертурная диафрагма в положении 1 – открыта; 2 – прикрыта. При одинаковой разрешающей способности d, ГРИП Н 2 больше, чем ГРИП H 1.
Разрешающая способность — это способность глаза или оптического прибора различать мелкие детали, т. е. наименьшее расстояние между изображениями двух соседних точек (линий), которые различаются как два отдельных изображения. Для нормального глаза предельное угловое разрешение составляет около 1", что соответствует 0, 0045 мм на сетчатке. Разрешающая способность является одним из наиболее важных параметров микроскопа, определяющих качество получаемого изображения. Она зависит от числовых апертур объектива и конденсора, а также длины волны света. Волновые свойства света определяют предел разрешения в оптических приборах. По дифракционной теории образования изображения в световом микроскопе Аббе нельзя видеть объекты меньше полудлины волны и нельзя получить изображение меньше полудлины волны: d>0, 5 λo / AОБ, где d — разрешающая способность микроскопа, мкм; λo — длина волны, мкм; AОБ — числовая апертура объектива.
Аберрации — это искажения или отступления в изображении объекта от идеального, это нарушение идеальности построения изображения в единой плоскости, расположенной перпендикулярно оптической оси микроскопа. Различают два вида искажений: осевые и полевые аберрации, для одной длины волны — монохроматические и для трех основных длин волн (красной, зеленой, синей) — хроматические. Монохроматические аберрации включают в себя: сферическую аберрацию, кому, астигматизм, кривизну поля, дисторсию. Хроматические аберрации включают в себя: хроматизм положения, хроматизм увеличения, сферохроматические аберрации. Для компьютерной микроскопии наибольший интерес представляют хроматические аберрации (цвет) и полевые аберрации (искажение геометрических составляющих объекта по полю).
Хроматические аберрации, обусловленные зависимостью показателей преломления оптических сред оптической системы от длины световой волны, связаны с тем, что оптическая система, преломляя лучи света, разлагает белый свет на составные части. При этом образуются в каждом цвете отдельные изображения, расположенные на различных расстояниях от системы. Хроматическая аберрация положения связана с тем, что лучи различных длин волн пересекаются в разных местах вдоль оптической оси. В соответствии с этим будет происходить наложение друг на друга изображений, которые различаются по цвету и по-разному сфокусированы. Это выражается в том, что изображение объекта имеет вид «слоеного пирога» , когда разноцветные изображения накладываются друг на друга. Хроматическая аберрация увеличения связана с тем, что изображения, образованные лучами разных длин волн, имеют разную величину, но расположены в одной плоскости фокусировки. Это выражается в том, что изображение объекта имеет разноцветную окантовку. Хроматическая аберрация увеличения
Полевые аберрации 1. Астигматизм 2. Сферическая аберрация 3. Кривизна изображения (поля) 4. Дисторсия
Астигматизм и сферическая аберрация Астигматизм характеризуется тем, что лучи от объекта собираются в двух взаимно перпендикулярных плоскостях изображения, которые разнесены друг от друга на некоторое расстояние. Сферическая аберрация характеризуется тем, что лучи света, вышедшие из точки объекта, расположенной на оптической оси, после преломления (отражения) всеми элементами оптической системы фокусируется в разных плоскостях. Вследствие этого существует не единая плоскость, где формируется изображение объекта, а создается некая область (объем), где трудно найти резкое изображение объекта.
Кривизна изображения (поля) и дисторсия Кривизна изображения (поля) характеризуется тем, что изображение плоского объекта располагается на неплоской поверхности. Кривизна поля чаще всего задается при расчете оптической системы: чем меньше расчетная кривизна поля, тем сложнее оптическая схема. Дисторсия вызывает искажение изображения объекта, проявляющееся в нарушении геометрии. Эта аберрация полевая и является расчетной. Дисторсия возникает из-за несоблюдения условий, связанных с постоянством линейного увеличения, которое создает оптическая система в плоскости изображения. Искажения обнаруживаются и усиливаются от центра к краю. Дисторсия может быть подушкообразной (положительной) с вогнутыми сторонами квадрата, при этом линейное увеличение по мере удаления от оптической оси возрастает, и бочкообразной (отрицательной) с выпуклыми сторонами квадрата, при этом линейное увеличение уменьшается по мере удаления от оптической оси.
Методы контрастирования в микроскопах отраженного света Для лабораторных исследований в металлографии наиболее распространенными являются три метода исследования и контрастирования: • светлое поле; • темное поле; • поляризация, а в последнее время к ним добавились: • дифференциально-интерференционный контраст (ДИК); • люминесценция.
Метод светлого поля в отраженном свете Базовым методом наблюдения и исследования в отраженном свете, как и в проходящем свете, является светлое поле. Свет от источника попадает на полупрозрачное зеркало с отражательной стороны и через объектив попадает на предмет. Отразившись от объекта, свет через объектив проходит полупрозрачное зеркало, обладающее пропускной способностью, в направлении оптической оси. Принципиальная схема реализации метода светлого поля в отраженном свете: 1 — источник света; 2 — полупрозрачное зеркало; 3 — объектив; 4 — плоскость предмета; 5 — тубусная линза; А — контрастирующий элемент со стороны освещения; В — контрастирующий элемент со стороны наблюдения; С — пространство для размещения элементов, оказывающих влияние на оба хода лучей
Метод темного поля в отраженном свете В отличие от светлого поля, темное поле формируется за счет создания кольцевого светового потока, который с помощью кругового эпизеркала, установленного в корпусе объектива, и кольцевого зеркала в плоскости полупрозрачной пластины направляется в рабочую зону, минуя основную оптику объектива. Для создания кольцевого освещения используется специальная диафрагма. Представленная на рисунке схема усложнена за счет введения зеркал. Однако она показывает сущность создания «чистого» светового потока и образования так называемых «ловушек» для бликов от краев диафрагм. На самом деле применяется фигурная диафрагма, полученная с помощью штамповки и зачерненная для уменьшения бликов, а полупрозрачная пластина аналогична полупрозрачному зеркалу, применяемому в светлом поле. Принципиальная схема работы микроскопа по методу темного поля: 1 — источник света; 2 — диафрагма темного поля; 3 — полупрозрачное зеркало; 4 — эпизеркало
Переключение в режим темного поля Переключение режима светлогого поля BF (Bright field) в режим темного поля DF (Dark field)
Некоторые примеры использования темного поля
На первый взгляд можно было бы сделать предположение, что изображение, получаемое темнопольным методом является просто негативом по отношению к получаемым светопольным методом, однако, на самом деле, каждый из этих методов делает видимым разные особенности образца. В светлопольной микроскопии особенности видимы, если они или производят тени, или имеют отличный от окружения коэффициент преломления и при этом достаточно резкие, в то время как, например, плавные неоднородности не могут быть наблюдаемы этим методом, однако, хорошо заметны на картинках, получаемых методом темнопольной микроскопии.
Нетравленый шлиф в светлом и темном поле
Метод поляризации Метод контрастирования, связанный с поляризацией света, оптимален для исследования поверхностей со структурами, изменяющими состояние поляризации света при отражении, например, анизотропные зерна в пробах руды, шлифах металлов и керамики. Особенностью микроскопа является наличие в оптической схеме поляфильтров: в осветительной части — поляризатора, а в промежутке между объективом и окуляром — анализатора. Наблюдение производится тогда, когда оба поля фильтра развернуты друг относительно друга близко 90°. При этом в поле наблюдается максимальное затемнение. Если объект обладает поляризующими свойствами, то на темном фоне появляется светлый или разноцветный объект с четким изображением по контуру. В микроскопе отраженного света поляризатор расположен в плоскости приближенной к коллектору, в то же время анализатор устанавливается в блоке светоделительного элемента и может быть выполнен вращающимся на угол 360°. Изображение при наблюдении в отраженном свете методом поляризации
ДИК-метод Метод дифференциально-интерференционного контраста является развитием метода поляризационной микроскопии. Он применяется для визуализации объектов с минимальными различиями по высоте неровностей на поверхности. Применение дифференциально-интерференционного контраста (ДИК) позволяет повысить контраст изображения и увеличить разрешающую способность микроскопа за счет получения «псевдостереоэффекта» .
Формирование ДИК-контраста Основным оптическим компонентом, обеспечивающим этот способ наблюдения, является двоякопреломляюшая призма Номарского. Она расположена между объективом и оптической системой микроскопа; находится на пути пучка света к образцу и расщепляет поляризованный пучок света на два частичных пучка (обыкновенный и необыкновенный). Если поверхность совершенно плоская, то ничего не происходит. Однако, если между двумя частичными пучками имеется небольшая ступень (перепад), то один из двух частичных лучей должен пройти путь на 2 Δh длиннее и приобретает разность хода. Проходя вторично через призму, отраженные лучи воссоединяются. После анализатора когерентные компоненты этих лучей, имеющие одинаковое направление колебаний, интерферируют в промежуточном изображении. Получается двойное изображение объекта, однако, раздвоение настолько мало (близкое к пределу разрешения объектива), что его практически не видно, и объект воспринимается рельефным. Схема получения дифференциальноинтерференционного контраста в прямом микроскопе отраженного света: 1 — источник света; 2 — поляризатор Р; 3 — полупрозрачное зеркало; 4 — ДИК-призма; 5 — объектив; 6 — плоскость предмета; 7 — анализатор А; 7 а — положение компенсатора
Изображение при наблюдении методом ДИК в отраженном свете
Изображение при наблюдении методом ДИК в прямом и отраженном свете Светлое поле Изображение в ДИК - контрасте
ДИК-метод применяется для исследования не травленных или слаботравленных шлифов. При наблюдении травленных и сильно-травленных шлифов разница в контрасте по сравнению со светлопольным изображением практически отсутствует.
Скачать презентацию АВТОМАТИЗИРОВАННЫЙ АНАЛИЗ ИЗОБРАЖЕНИЙ ДЛЯ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ Раздел 2
razdel_2_-_osen-2014.ppt