Ассоциации и симбиозы с микроорганизмами Ассоциация это

Ассоциации и симбиозы с микроорганизмами Ассоциация – это сообщество организмов, которые встречаются вместе и (или) развиваются обусловлено Симбиоз (от греч. совместная жизнь) – взаимосвязанная система, в которой оба партнера способны по крайней мере теоретически к автономному существованию (А. де Бари) • происхождении организмов путем симбиоза (А. С. Фаминцын доказал (1867, совместно с О. В. Баранецким) симбиотическую природу лишайников • происхождение организмов путем комбинации или соединения 2 -х или нескольких существ, вступающих в симбиоз - симбиогенез (К. С. Мережковский) (носители пигментов в растительной клетке)

Симбиогенез • митохондрии – внедрение древней аэробной клетки в анаэробный прокариотный организм • развитие ресничек, жгутиков, митотического веретена – результат симбиоза со спирохетоподобной бактерией • появление хлоропластов – превращение цианобактерий в эндосимбионтов первичных эукариот • клеточные структуры эукариот возникли не путем внутриклеточной дифференцировки, а в результате серии симбиозов (Л. Маргулис)

Симбиогенез Происхождение эукариотной клетки путем симбиоза сначала с оксифильными бактериями (предками митохондрий), а потом - со спирохетами (предками жгутиков) Происхождение хлоропластов красных водорослей путем симбиоза с цианобактериями

Типы симбиозов По степени близости экз-, экто- и эндосимбиозы По степени уравновешенности пользы и вреда мутуализм (+ +) – крайняя степень уравновешенности, выгодно для обоих партнеров, паразитизм (+ -) – выгодно только одному партнеру, а другому вредно По степени взаимозависимости партнеров факультативный и облигатный симбиозы

Функции симбиозов • защита • предоставление благоприятного местообитания • питание

Эндосимбиозы (простейшие) • Внутри реснитчатой инфузории Paramecium живут бактерии в виде скрученной ленты (каппа-частицы). Размножение этих бактерий находится под контролем генов хозяина. • Бактерии выделяют в цитоплазму парамеции витамин фолиевую кислоту, которую простейшее не может синтезировать • Штаммы-киллеры Paramecium aurelia с помощью каппа-частиц убивают особи того же вида, у которых эти бактерии отсутствуют • Бактерии, попадают путем фагоцитоза в чувствительные клетки парамеции, раскручиваются и разрывают мембрану пищеварительной вакуоли, ферменты из нее выходят цитоплазму и вызывают лизис клеток

Эндосимбионты Acanthamoeba trophozoites Alphaproteobacteria, Rickettsiales, 99, 6 % similarity Fritsche et al. , 1999

Эндосимбиозы (простейшие) в цитоплазме, в вакуолях, в эндоплазматической сети, в митохондриях жгутиконосцев, обитающих в кишечнике термитов и в рубце жвачных, обитают бактерии, которые образуют целлюлазы спириллы, обитающие внеклеточно на плазматической мембране жгутиконосцев из кишечника термитов – движение

Эндосимбионты нематод Нематоды сем. Steinernematidae и Heterorhabditidae (биологические инсектициды) Инфекционные личинки (дауэр) нематод Steinernema carpocapsae Передний отдел кишечника дауэр-личинки Heterorhabditis bacteriophora с карманом, в котором живет симбиотическая бактерия Xenorhabdus sp. Миграция дауэр-личинки H. bacteriophora из личинки Tipula paludosa Бактерии • комменсалы нематод • паразиты насекомых Photorgaphs by R. -U. Ehlers, University of Kiel, Germany

Эндосимбиозы • у насекомых (личинок и имаго жуков анобиид) возникают внутриклеточные эндосимбиозы с дрожжами и грибами; микроорганизмы живут внутри клеток среднего отдела кишечника – мицетомах • грибы обеспечивают организм хозяина витаминами группы B и стеролами; животные не растут без симбионтов • в гепатопанкреатических железах (пищеварительный орган) мокриц присутствует бактерии • у разных видов бактерии имеют разную морфологию тонкие палочки диаметров около 0, 3 мкм и длинной от 2 до 37 мкм • не удается культивировать на искусственных средах • вход в железы перекрыт сеткой с размером ячеи меньше размеров, чем размеры бактерий

Внутриклеточные бактерии (красное) в заднем отделе кишечника и в вилке коллемболы Folsomia candida (FISH с пробой EUB 388)

Эктосимбиозы

Критерии, позволяющие выделять кишечную группировку микроорганизмов • Специфика состава • Устойчивость к режимам содержания и питания • Устойчивость к перевариванию • Функциональная роль

Эктосимбиозы коллембол строение кишечника (А); бактерии на перитрофической мембране (Б) А Б • Объем кишечника 6 -12 нл (заполненный), 1 нл пустой • Объем экскрементов 1 нл

Бактерии в кишечнике коллемболы Folsomia candida • активно питающиеся животные: 1, 6 х 104 - 2, 7 х 105 КОЕ/особь • не питающиеся животные до линьки: 2, 3 х 106 КОЕ/особь • не питающиеся животные сразу после линьки: 4, 9 х 102 КОЕ/особь • в процессе линьки сообщество бактерий сильно перестраивается, отбираются быстрорастущие • колонизация происходит из экскрементов

Реколонизация кишечника коллемболы бактериями после линьки А – начало заднего отдела (пилорус) с остатками бактерий; Б – бактерии в заднем отделе. Бактерии (красным) обнаружены методом FISH с пробой 16 S r. РНК EUB 388 (Thimm and Tebbe, 2003) А Б

Низшие термиты Mastotermes darwiniensis и их пищеварительный тракт

Низшие термиты • питаются низкоценными субстратами, содержащими много целлюлозы, но мало азота и белков (wood feeding) • могут сами образовывать С -целлюлазы, но не С –целлюлазы x 1 • в среднем отделе кишечника p. H 6, 0 -7, 0; условия аэробные • в центральной части просвета заднего отделе кишечника (около 40% от объема) - строго анаэробные условия – Eh = -230 -270 m. V • ближе к стенкам кишечника условия микроаэрофильные

Симбионты низших термитов • плотность популяций бактерий в заднем отделе 10 - 10 9 10 клеток/мл, простейших 107 клеток/мл (около 60% массы содержимого кишечника термита) • у низших термитов отношение простейшие: бактерии около 1: 100, а в рубце жвачных – 1: 100000 • культивированию поддаются только 3 вида простейших жгутиконосца: Trichomitopsis termopsidis, Trichonympha sphaerica, Trichomitus trypanoides

Биомасса немицелиальных и мицелиальных прокариот (мг/г содержимого кишечника) в пищеварительном тракте термита Cubitermes severus (прямая микроскопия, Brauman et al. , 2000) В 100 раз больше, чем в почве

Симбионты низших термитов • факультативные анаэробы: сем. Enterobacteriaceae, Staphylococcus, Bacillus, Streptococcus – по периферии • в центре кишечника обитают строгие анаэробы рода Bacteroides, Fusobacterium, спирохеты, свободно плавающие в кишечной жидкости и прикрепленные к реснитчатым простейшим (подвижный симбиоз) - не культивируются на искусственных средах • строгий анаэробиозис - бактерии, прикрепленные к кишечному эпителию, поглощают кислород при дыхании и не допускают его, вглубь кишечника

Бактерии на поверхности и вблизи эпителия в заднем отделе в кишечнике термита (Breznak, Pankratz, 1977)

Соотношение поверхности к объему рубца жвачных и заднего отдела кишечника низших термитов Рубец жвачных Кишечник термита • Термиты активно регулируют концентрацию О 2 в кишечнике

Симбиотическое переваривание у низших термитов (модель R. Hungate) • термиты обгрызают и измельчают древесину • частицы древесины поглощают простейшие, обитающие в заднем отделе • целлюлоза, ксиланы, маннаны гидролизуются анаэробно до мономеров • сбраживаются до СО , воды, ацетата, пропионата, бутирата, лактата, 2 формиата • ацетат используется термитом за счет аэробного окисления в клетках эпителия кишечника

Симбиотическое переваривание у низших термитов (модель R. Hungate) • простейшие питаются бактериями в заднем отделе • бактерии – строгие анаэробы (метаногены); образуют метан из H и CO 2 (сток электронов) 2

Упрощенная схема процессов переваривания в бродильной камере низших термитов 2 мкм 1 мкм

Метаболические реакции, происходящие в заднем отделе кишечника низших термитов (модель R. Hungate)

Продукция метана • термиты - источник метана в атмосфере • при питании чистой целлюлозой термит образует более 1000 нмоль CH 4 /г в час • 100 мг СH /г биомассы в год – тысячи тонн в год 4 • метан образуют термиты, тараканы, многоножки и жуки скарабиды (проверено 110 особей 35 таксонов)

Метаногенные археи в заднем отделе артропод (Hackstein et al. , 2006) Автофлюоресценция кофактора F 420

Азотфиксация • термиты имеют бактериальных симбионтов (Citrobacter freudii, Enterobacter agglomerans и др. ), осуществляющих фиксацию N 2 • за счет азотфиксаторов они могут покрывать до 50% нужд в азоте; активность азотфиксаторов тем выше, чем ниже концентрация азота в корме (Breznak, Pankratz, 1977)

Способность термитов концентрировать азот • накопление метаболических отходов: мочевая кислота • переваривание и ассимиляция кишечных микробов, продуктов их лизиса и экскретов • кишечные симбионты осуществляют анаэробный гидролиз мочевой кислоты (как источник энергии) до NH 3, CO 2, ацетат • аммоний используется термитом с участием глютаминсинтетазы • аммоний может использоваться бактериями в заднем отделе; бактерии лизируются и потребляются термитом

Высшие термиты • представляют до 80% от всех термитов; питаются почвой • в верхних отделах кишечника щелочные условия (p. H = 12) и строгий анаэробиозис, щелочной гидролиз почвенного ОВ, и здесь не живут бактерии • продукты гидролиза поступают в следующий отдел кишечника, где p. H падает до 8, 0 -8, 5, а парциальное давление О 2 приближается к условиям в почве - факультативно-анаэробные бактерии • далее - еще одна анаэробная зона • в следующей аэробной зоне обитают актиномицеты; актиномицеты выделяют антибиотики, убивают “прибывающие” к ним бактерии и питаются ими • продукты разложения бактерий использует термит

Гипотетическая организация кишечника термита, питающегося почвой (Bignell, 2000) Внешний рубец: в экскрементах происходит разложение и созревание ОВ за счет стимуляции микробной активности P 3 с аэробной периферией и анаэробной серединой Передний P 1 отдел c перистальтикой Измельчение Зоб Средний отдел P 4 b с пери- и антиперистальтикой Mixed сегмент почва, богатая ОВ, минеральными частицами и микробами Протеиназы? конечные продуты? Лабильные конечные продуты Отбор илистых и глинистых фракций Не ферментативная секреция или лизис вошедших микробов? Секреция K+; прорастание гиф и их перемешивание с почвой Щелочной гидролиз при p. H более 12, 0 Брожение в середине и минерализация по периферии просвета Лабильные конечные продуты Нейтрализация щелочного p. H, аэробное разложение и созревание ОВ

p. H парциальное давление О 2, м. Бар Профиль парциального давления кислорода и p. H вдоль кишечника питающегося почвой термита Thoracotermes macrothorax щелочной гидролиз ФАБ длина, мм актиномицеты

Радиальные профили парциального давления O 2 и H 2 в заднем отделе кишечника высшего термита (микросенсорное измерение, Brune et al. , 1995) Микроаэро- Стенка кишечника Анаэро-

Факторы, определяющие пригодность пищеварительного тракта для колонизации микроорганизмами • стабильность и относительная прочность кутикулярного слоя • секреция метаболизированных питательных и экскреторных продуктов • смягчение относительно твердых кутикулярных слоев жидким течением • амортизация кислотно-основных и окислительно восстановительных условий • перемешивание содержимого полости контактами со стенкой кишечника

FISH (fluorescent in situ hybridization)

Бактерии в кишечнике червей Aporrectodea caliginosa и Lumbricus terrestris (посев-PCR) Aporrectodea caliginosa Lumbricus terrestris 7 общих видов Кишечные группировки бактерий у разных червей сильно различаются

Бактерии, ассоциированные с кишечником диплопод Местообитание Бактерии Пристеночное сообщество Klebsiella pneumonia, Enterobacter cloacae, Plesi omonas sp. , сообщество Кишечная жи д кость Перитрофическая мембрана Полостное сообщество Promicromonospora citrea, Streptomyces chr ysomallus, S. ca ndidus, Stre ptoverticillium s p. , Micromonospora spp. , Bacillus spp. Salmonella sub sp. , Alcaligenes xylosooxidans , Burkholderia cepacia, Pseudomonas fluore s cens Enterobacter cloacae, S. badius, S. fluore s cens, S. xanthocidicus, S. filamentosus Pseudomonas sp. , Flavobacterium sp. , Promicromonospora sp. , Rhodoco ccus sp. , B acillus spp. , S. ca rpaticus, S. griseolus, S. pse udogrise olus, S. paucid iastat icus, S. felleus, S. chrysoma llus, S. aburaviensis, S. n itrosporeus, S. gl obisporus, S. pl uricolorescens, S. longisporoflavus, S. echin atus Streptosporangium albidum, Micromonospora spp. , Actinomadura spp.

Дрожжи, ассоциированные с кишечником диплопод состав Debaryomyces hansenii Zygowilliopsis californicus Torulaspora delbrueckii Pichia membranaefaciens Geotrichum candidum Kloekera apis Pichia guilliermondii Trichosporon cutaneum Hyphopichia burtonii численность 105 КОЕ/г кишечника или 104 / кишечник

Бактерии в кишечнике червей Aporrectodea caliginosa и многоножек (29 видов) Черви (посев-PCR) Многоножки (посев - фенотип) • Кишечные группировки бактерий у червей и многоножек различны Нет общих

Функции кишечных микроорганизмов диплопод и дождевых червей

Функции кишечных микроорганизмов диплопод

Симбионтное питание у кивсяка Pachyiulus flavipes 1 – экзогенные, поступающие с пищей, 2 – автохтонные кишечные 3 – лизированные

Устойчивость к колонизации Антагонистическое действие на грамположительные Г (+) и грамотрицательные Г (-) бактерии кишечника встречаемость случаев (%), когда актиномицеты образовывали зону подавления роста бактерии >1 мм Бактерии, ассоциированные с Актиномицеты, ассоциированные с почвой червями кивсяками Г+ Г- 25 25 13 20 25 38 червями (1: 7) 75 20 56 18 50 23 кивсяками (4: 4) 38 13 34 23 46 23 почвой (1: 3)*

Патогенез колонизация дрожжами Pichia guilliermondii кишечника диплоподы Glomeris connexa при искусственном заражении Гибель животных 7 lg КОЕ/г 6 5 4 задний отдел средний отдел 3 2 передний отдел корм 1 0 108 107 106 104 К

Экзосимбиозы • среди высших термитов есть группа фуражеров • питаются трудно разлагаемыми кормами, бедными азотом • переваривание субстратов осуществляют, используя ферменты грибов, которых они выращивают • инокулируют растительные остатки грибами, которые и специально культивируются в термитниках: Termitomyces • могут сами синтезировать только Cx-целлюлазу (β-глюконазу) (слюнные железы, ткани среднего отдела кишечника) • потребляя грибы, получают дополнительные ферменты и, таким образом, переваривают целлюлозу

Экзосимбиозы • аналогичным приемом пользуются муравьи-листорезы (личинки древесных ос, амброзиевые жуки) • грибы или их эксудаты являются пищей личинок, но составляют только небольшую часть диеты взрослых муравьев • грибные ферменты не играют столь существенной роли в переваривании целлюлозы личинками муравьев, как у термитов, но они не инактивируются при пассаже и выходят с экскрементами, продолжая “работать” в субстрате • экскременты личинок муравьев играют важную роль в поддержании культуры грибов в садах: фекальная жидкость, попадая на свежесрезанные листья, ускоряет рост грибов за счет привнесения грибных же ферментов

Синтетические функции микробных симбионтов беспозвоночных • синтез факторов роста – витаминов • синтез незаменимых аминокислот • синтез ненасыщенных жирных кислот (линолевая, линоленовая) • синтез простагландинов • синтез стеринов • синтез антибиотиков

Взаимодействия организмов и биосферные функции почв Разложение и минерализация органического вещества Образование гумуса Судьба популяций и сообществ Вермикомпостирование отходов Продуктивность микроорганизмов Фиксация азота, денитрификация Круговорот биогенных элементов Биоразнообразие Динамика паразитов и патогенов Генетический обмен Распределение микроорганизмов в почвенном профиле • Взаимодействия микроорганизмов и беспозвоночных животных определяют важнейшие почвенные процессы