APLICASI ELEKTROFORESIS DALAM FARMASI Sediaan Farmasi yang

APLICASI ELEKTROFORESIS DALAM FARMASI • Sediaan Farmasi yang diproduksi dipabrik obat tidak saja obat yang bersifat mikromolekul, tetapi juga yang bersifat makromolekul. • Senyawa makromolekul terutama yang merupakan senyawa bioaktif, (senyawa bio kimia) juga perlu diketahui cara analisisnya. • Analisis paling umum dipakai adalah elektroforesis. Walaupun perkembangan teknologi senyawa tersebut dapat analisis dengan KCKT. 1

Principles of Electrophoresis Faktor yang menyebabkan pemisahan Muatan molekul Bobot molekul Bentuk molekul Molekul dipengaruhi oleh medan listrik V = (EQ)/f V = molecule velocity E = Eletric field strength Q = molecular charge F = friction coefficient of molecule Hasil pemisahan yang tinggi sangat tergantung berbagai faktor seperti rumus tersebut 2

I. Applications Elektroforesis Gel Analysis of carbohydrates Analysis of inorganic anions/metal ions DNA profiling Protein identification Advantages Fast Small Sample Relatively inexpensive Automated Disadvantages Cannot identify neutral species (Kecuali yang osmosis) Joule Heating Cannot discern shape

Migrasi sampel Katode 4 Anode 45 k. D 10 k. D 25 k. D

Electrophoresis Dan Buffer Beberapa jenis larutan yang dianjurkan untuk electro phoresis DNA adalah; TAE (Tris-acetate-EDTA) and TBE (Tris-borate-EDTA). Fragmen DNA akan migrasi dengan kecepatan yang berbeda dalam kedua dapar tersebut dan sangat tergantung kekuatan ion. Buffer tidak saja untuk mempertahankan p. H, tetapi memberikan ion yang membantu sifat konduktivitas Bila digunakan kadar dapar 10 x lebih kuat dari larutan stok, suhu dapat naik pada proses elektroforesis gel dapat memeleleh 5

Assessing DNA Quality Time minutes 3 2 seconds 1 45 30 15 0 Experiment: F 100 ng K 562 DNA F Digest with DNAse ~23 Kbp Molecular Weight Ladder ~ 2 kbp 6

Pengaruh Konsentrasi Agarose ØDalam praktek pemisahan DNA dipengaruhi oleh ketebalan fase diam (media elektro foresis) maupun BM dari sampel. Ø Slide (6)mengalami peruraian ternyata migrasi lebih cepat dibanding dengan sebelum peruraian. Ø Slide (8), menunjukkan agrose(media elekt. ) yang kadar tinggi memperlam bat migrasi 7

Agarose (%) 0. 3 60 - 5 0. 6 20 - 1 0. 7 10 - 0. 8 0. 9 7 - 0. 5 1. 2 6 - 0. 4 1. 5 8 Range of separation of linear DNA (in kilobases) 4 - 0. 2 2. 0 3 - 0. 1

Acrylamide Gel Electrophoresis Effect of Gel Percentage and Size Separation 9

II. Protein staining 1. Pengecatan Coomasie blue 2. Pengecatan Dengan Ag. NO 3 10 z Silver stain

c. Commonly used protein stains Stain Ponceau S 1 -2 g Reversible Amido Black 1 -2 g permanent; low background Coomassie Blue 1. 5 g permanent; high background India Ink 100 ng permanent Silver stain 10 ng permanent Colloidal gold 11 Detection limit Comment 3 ng permanent

(2) DNA staining: Ethidium bromide bergabung dengan DNA double helix and fluoresced bila disinari dengan UV 12

d. Pewarnaan sampel dengan Ethidium Bromide 13

Electrophoresis of Nucleotides z. DNA mempunyai mutan negatif ( karena kerangka phosphate ) z. DNA akan tertarik pada muatan positif baik dari elektrode maupun dapar, sebaliknya akan ditolak oleh muatan negatif. 14

Ethidium Bromide Senyawa mempunyai gugus planar yang dapat ber intercalates diantara base DNA. Sifat tersebut menyebabkan kenaikan sifat flouresensinya dibanding senyawa dalam keadaan bebas (dalam larutan) Radiation U. V. pada 254 nm diabsorbed oleh DNA dan ditransmisikan kepada zat warna yang terikat, dan dapat mengemisikan warna pada 590 nm (orenye kemerahan) 15

Ethidium Bromide Ethidium bromide biasanya dibuat dengan larutan 10 mg/ml. Disimpan dan terlindung (kedap cahaya). Zat warna kurang berinteraksi atau incorporated kedalam gel dan dapar yang digunakan. Tetapi gel dapat berwarna setelah dikocok dengan ethidium bromide (0. 5 ug/ml selama 30 min). dan dielusi dengan larutan. Warna akan tampak bila disinari dengan UV dan dapat dipotret dengan film polaroid. Kepekaan DNA terhadap zat warna ini bila kadar DNA minimal 0. 1 ug of DNA. 16

Gel Staining 17

An ethidium-stained gel photographed under UV light 18 **Each band that you see is a collection of millions of DNA molecules, all of the same length!!

Movement of DNA fragments in agarose gels (Mobilitas fragmen DNA dalam agorose sel) Ada hubungan yang linier antara kecepatan migration setiap fragmen DNA dan logaritma dari ukuran molekul (in basepairs). Molekul yang besar bergerak lambat karena pengaruh friksi yang lebih besar Bila digambarkan dengan kurva sebagai berikut: 19

base pairs x bp Distance migrated

Types of Polyacrylamide gels Denaturing gels : Gel ini mengalami polimeri sasi dengan denaturant, terutama yang bersifat dapat berpasangan dengan asam nucleat seperti urea, atau formaid. . Denatured DNA Yang telah terdenaturasi akan migrasi melewati gel poliakrilamid tak terjadi reaksi (independen) atau dapat bergantian, hasil migrasi sebagai berikut: 21

Methods for Fluorescently Labeling DNA • Intercalating Dyes (post-PCR =polimeric chain reaction)) • Dye-labeled nucleotide insertion during PCR • Dye-labeled primer insertion during PCR 3’TGCATCTACGATGTAATCG 5’ CGTAGCTG 3’ Linkers, dyes, etc. can be added to the 5’ end of the primer without disturbing the reaction. Individual bases can also be tagged ENZYME Intercalation process Covalent labeling process 22

Amine Reactive Dyes used in Labeling. DNA FAM (Blue) JOE (Green) Emission 520 Emission 548 NH 2 + O 23 TAMRA (Yellow) Emission 580 ROX (Red) Emission 605 NH O N N O Pewarna O

Dye Migration in Different % Polyacrylamide Gels % Polyacrylamide gel Bromophenol blue Xylene cyanol (41) 5 130 6 26 106 8 19 76 10 12 55 12 24 35 8 28

Sebelum terjadi pemisahan analit dikumpulkan dulu , kemudian dengan membe rikan arus listrik terjadilah perbedaan potensial, sehingga terjadi pengelompokan iom positif dan negatif. Dengan demikian pemberian potensial dapat diatur agar pemisahan dapat mencapai optimal. 1. TEKNIK INJEKSI: 1). Hidrostatik, dengan tekanan cairan Besarnya tekanan tergantung volume cairan dirumuskan: g ht. INJ =BOBOT JENIS V= volume VINJ =—————— h= SELISIH TINGGI LAR. 8 L g = GAYA GARVITASI =VISKOSITAS, t= LAMANYA PENYUNTIKAN. 25

26 Contoh gambar penyuntikan

SUSUNAN ALAT 27

Isoelectric focusing (IEF) Perpindahan(pergerakan) cairan pada pipa kapiler akan terus berlangsung sepanjang larutan memiliki muatan atau diberi muatan, apabila kondisi sudah menjadi netral maka cairan akan berhenti bergerak pada p. H tti. (PI) 28

2. Aplikasi IEF (Isoelectric focusing)berguna untuk menentukan p. I dari protein, terutama dalam memisahkan immunoglobulin , variasi hemoglobin dan menentukan posisi translational modifikasi dari protein rekombinan, separasi campuran protein dapat dilihat pada gambar dibawah: 29

• DNA Aplikasi Pemisahan oligonucleotida dan sekuen produk DNA melibatkan agar polyacrylamide, gambar dibawah menunjukkan hasil separasi 30

Sample Injection in CE Hydrodynamic injection uses a pressure difference between the two ends of the capillary P d 4 t Vc = 128 Lt Vc, calculated volume of injection P, pressure difference d, diameter of the column t, injection time , viscosity Electrokinetic injection uses a voltage difference between the two ends of the capillary Qi = Vapp( kb/ka)t r 2 Ci Q, moles of analyte vapp, velocity t, injection time kb/ka ratio of conductivities (separation buffer and sample) r , capillary radius Ci molar concentration of analyte

Capillary Isoelectric Focusing (CIEF) v Capillary Isoelectric Focusing (CIEF) allows amphoteric molecules, such as proteins, to be separated by electrophoresis in a p. H gradient generated between the cathode and anode. v A solute will migrate to a point where its net charge is zero. At the solute’s isoelectric point (p. I), migration stops and the sample is focused into a tight zone. v In CIEF, once a solute has focused at its p. I, the zone is mobilized past the detector by either pressure or chemical means. This technique is commonly employed in protein characterization as a mechanism to determine a protein's isoelectric point.

IV. Capillary Isotachophoresis (CITP) Ø Capillary Isotachophoresis (CITP) adalah bedasar perbedaan sampel mana yang leading (pendahulu) dan mana yang termiting (yang akir) dari suatu elektrolit. . Ø Analit yang intermediata akan terletak diantara pendahulu dan yang akir dari analit, dengan bentuk tajam dan terfocus. (focused Zone). Ø Walaupun ini digunakan untuk model pemisahan tetapi sebelumnnya merupakan pemusatan dari sampel lebih dulu.

Analisis Metadon dan isomernya Metadon (MTD), sebagai analgesi yang sintetik, biasnaya digunakan untuk obat pengganti opiat yang tidak adiktif. Obat ini mempunyai atom karbon asimitris sehingga terdapat beberapa isomer seperti: R)-MTD. , (S)-MTD [2, 3]. Dan hasil metabolisme menjadi 2 - ethylidene-1, 5 -dimethyl-3, 3 -diphenylpyrrolidine (EDDP), and to 2 -ethyl-5 -methyl-3, 3 -diphenylpyrrolidine (EMDP). Untuk pemisahan yang optimum , dengan elektroforesis kapiler (EK) digunakan fase diam highly sulphated gammacyclodextrin (HS-CD) (Rudaz et al, 2003). Sebagai baku internal (standard internal), R)-(+)-1 phenylethylamine ((R)-PEA, yang dalam EK, senyawa ini kecepatan migrasinya tidak sama dengan sampel uji; 34

4 3 2 1 0, 0 Peak area (milli volt) (R)-PEA, (phenyl ethylamine) 0. 0 1 2 3 4 5 6 Migration time in minutes Electropherogram of an oral fluid sample spiked with 10 ng/m. L 35 (R)-PEA, used as internal standard (IS), obtained under optimized conditions: fused-silica capillary 375 m o. d. , m i. d. , 40. 2 cm total length (effective length 32. 8 cm); 50 m. M phosphate buffer, p. H 4. 5, 0. 2% HS--CD (w/v); applied voltage, 20 k. V; temperature: 20 ◦C, UV detection at 200 nm.

36 Electropherogram of an oral fluid sample spiked with 50 ng/m. L of (R, S)-MTD, (R, S)-EDDP and (R)-PEA (IS) using the same optimized conditions as in

Analysis of Hair Electrophoresis 1998, 19, 42 -50

Separation of natural isotopes of 0. 56 m. M Cl- by capillary electrophoresis with indirect spectrophotometric detection at 254 nm. (from C. A. Lucy and T. L. Mcdold, Anal. Chem. 1995, 67, 1074. )

Separation of alkaline, alkaline earths, and Lanthanides Capillary: 36. 5 cm 75 µm fused silica, 30 k. V. Detection: indirect UV, 214 nm. (D. A. Skoog, F. J. Holler, T. A. Nieman, Principles Of Instrumental Analysis, Fifth Edition, Sanders Coliege Publishing, 1998, 778)

Pemisahan kat ion S: system peak; 1: ammonium; 2: potassium; 3: calcium; 4: sodium; 5: magnesium; 6: zinc (Y. Fung, K. Lau, H. Tung, Talanta, 45, 1998, 619. )

Model Proteins separated at p. H= 2. 7 Peak No. Proteins 1 Cytochrome c 2 Lysozyme 3 4 5 Trypsinogen Trypsin inhibitor mol. Wt. 12, 400 14, 000 Isolelectric Point, PI 10. 7 10. 1 24, 000 10. 1 23, 700 20, 100 8. 7 4. 5

(H. B. Wan, J. Liu, Talanta, 45, 1998, 663)

(H. B. Wan, J. Liu, Talanta, 45, 1998, 663)

R=CH 2 OH R=NHCH 3 Chemical structures of tetracycline(A) and streptomycine(B). (H. B. Wan, J. Liu, Talanta, 45, 1998, 663)

(H. B. Wan, J. Liu, Talanta, 45, 1998, 663)

Conclusion The capillary electrophoretic methods have been recognized: 1. Lower equipment costs, smaller sample size requirements, much greater speed, high resolution, precision, to conventional HPLC methods, Comparedaccuracy and sensitivity. 2. The capillary electrophoresis methods have better resolution, less consumption of buffer solution and the absent organic solvents in the analysis. 3. Many types or method can be apllied. (H. B. Wan, J. Liu, Talanta, 45, 1998, 663)

Kemampuan senyawa berpartisipasi kedalam misel sangat tergantung sifat hidofobiknya a. ) Micell Electroforesis Senyawa yang dapat dianalisis dengan cara ini antara lain: morfin, kanabinol, barbi turat. Benzodiazepin, antibiotika dan vitamin Waktu retensi dirumuskan: k’ =Pmw. V[(S)-CMC) k’= waktu retensi, Pmw= koefisien partisi, S= kadar surfaktan, CMC = medium 47

b). OPEN TUBELAR CAPILARY ELECTROPHORESIS ATAU CAPILARY ZONE ELECTROPHORESIS (CZE) Gerakan analitnya berupa pita, terbuka karena bagian tengah kapiler hanya ada cairan netral, sedangkan didinding bagian tepi terdapat fase medium elektroforesis , hasilnya kurang bagus karena penghantaran listrik kurang sempurna. 48

c). CAPILLARY ISOTACKHOPHORETIK Dalam kapiler disuntikkan back ground elec trophoresis (bge), dengan keceapatan bge yang jauh lebih besar dari kecepatan migrasi sampel yang ionik. ( S). Setelah sampel disun tikkan, dan diberi arus listrik maka akan terjadi migrasi bersama. Capillary isotackhophoretik d). CIF Sebelum terjadi pemisahan analit dikumpulkan dulu , kemudian dengan membe rikan arus listrik terjadilah perbedaan potensial, sehingga terjadi pengelompokan iom positif dan negatif 49

Pemisahan senyawa dengan gugus amin yang berbeda 50

CONTOH s+ < BGE back ground elec trophoresis (BGE) s+ > t ` ` Gambar tahapan peristiwa dalam kapiler sebelum ada arus dan setelah diberi arus listrik. Kecepatan migrasi sangat tergantung akan muatan, dan bobot molekul. D). Elektroforesis dengan gel (capillary gel electrophoresis), peristiwa yang terjadi sama dengan citp. 51

Trima kasih