Антибактериальная активность Enterococcus faecium L 3 в присутствии

Антибактериальная активность Enterococcus faecium L 3 в присутствии лактобацилл Ермоленко Е. И. , Алехина Г. Г. , Суворов А. Н. НИИ Экспериментальной медицины РАМН

р. Н Иммуномодуляция Н 20 2 LAB Антагонизм или синергизм молочнокислые бактерии с полезными бактериями Бактериоцины Сайты прикрепления Органические кислоты

Цель n Исследование способности энтерококков отдельно и в присутствии лактобацилл подавлять рост грам-отрицательных и грам-положительных бактериий in vitro

Влияние приема штамма L-3 в составе драже «Ламинолакт» на состояние микрофлоры больных с хроническими гепатитами (Тимофеева Е. А. 2002)

Наиболее распространенные бактериоцины Гр+ бактерий

Генетический анализ штамма энтерококков L-3 А B Гены сериновой протеиназы L-3 Гены энтероцинов А и В Гены синтеза феромонов fsr

Бактериоцины E. faecium L-3 ПЦР клонирование секвенирование (А. Н. Суворов ) n MKHLKILSIKETQLIYGGTTHSGKYYGNGVYCTKNKCTVD WAKATTCIAGMSIGGFLGGAIPGKC – Enterocin А, 5, 5 k. D n MQNVKXLSTKEMKQIIGGENDHRMPNELNRPNNLSKGG AKCGAAIAGGLFGIPKGPLAWAAGLANVYSKCN Enterocin В 5, 6 k. D

Бактериоцины энтерококков n : цитолизин (Tendolkar S. et al, 2003) IIa (педиоциноподобные с антилистериозным эффектом): A (Aimerich T. et al, 1996), CRL 35 (Saavedra et al, 2004), мундтицин, ……. . IIb (2 -х компонентный): B (Casaus P. et al 1997) IIc (sec- зависимая секреция): L 50 A, L 50 B, P, Q (Cintas L. M. et al 1988), AS 68 (Diaz M. et al. , 2002), ……. . . III (большой, чувствительный к нагреванию): n энтеролизин А n n I (лантибиотик) (Nilsen T. et al, 2003)

Ранее выявлена антагонистическая активность E. faecium L 3 in vitro по отношению к: Pseudomonas sp. +++ n Escherichia coli +++ Staphylococcus aureus ++ Mycoplasma hominis +++ n Enterococcus spp. + n Proteus vulgaris + n Candida albicans (+)n Cryptococcus sp. + n Herpes simplex virus + n Lactobacillus spp. - n n n

Материал n Штаммы микробов: n Enterococcus faecium L 3 ( «Ламинолакт» , ООО n Lactobacillus fermentum 65, выделенный из урогенитального тракта n Индикаторные бактерии : Escherichia. coli АТСС 25922, Escherichia n n «Авена» ) coli JM 109, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Proteus vulgaris N 2, Listeria monocytogenes NH Streptococcus agalactiae ( типовой и 5 клинических изолятов) S. pyogenes (типовой и 5 клинических изолятов) Streptococcus sp. групп C и G (типовые штаммы), 3 клинических изолята Enterocсus spp. Питательные среды : МРС 1, МРС 4 (НИЦФ, Россия) , триптозный агар(“Ferax”, Germany), Колумбийский агар (Himedia, Индия) с добавлением бараньих эритроцитов или лошадиной сыворотки

Основные методы n n n Определение антагонистической активности лактобактерий методом двухслойного агара (Ермоленко Е. И. и др. 2004) и методом штрихов Ингибирование роста эшерихий в жидкой среде супернатантами культур энтерококков (Hechard Y. et al, 1975 ) Выделение биологически активных пептидов (Moreno M. R. et al, 2003) Определение антагонистической активности пептидов, выделенных из супернатантов по отношению к листериям и эшерихиям методом радиальной диффузии (Lehrer R. L. et al, 1991) Выявление генов, обеспечивающих продукцию бактериоцинов (А, В, P) и факторов патогенности (gel, esp, spr, cyl) энтерококков в ПЦР Оценка способности лактобактерий , продуцировать перекись водорода (ГОСТ 24067 -80 “Молоко. Метод определения перекиси водорода” (переиздание июнь 1987, с изменением № 1, утвержденным в январе 1986 г. , ИУС 5 -86)

Ингибирование роста Listeria monocytogenes различными белковыми фракциями супернатанта E. faecium L 3

Ингибирование роста E. coli различными белковыми фракциями супернатанта E. faecium L 3

Титрование биологически активных пептидов (Кокряков В. Н. , Алешина Г. М. )

Методика оценки антибактериальной активности лактобактерий (МРС 4/Трипт. Агар) количества LAB в нижнем слое агара

Определение МИКА - минимального ингибирующего количества антагониста

Определение антистрептококковой активноcти лактобактерий ( МРС 4/Колумбийский агар)

Антагонистическая активность E. faecium L 3 и L. fermentum 65, выращенных отдельно и совместно

Рост P. mirabilis 2 на поверхности 2 -х слойного агара с различным содержанием лактобактрий 3, 2 lg КОЕ/мл 2, 2 lg КОЕ/мл 1, 2 lg КОЕ/мл

Антагонистическая активность E. faecium L 3 , выращенных отдельно и в присутствии лактобацил, к листериям и энтерококкам

Антистрептококковая активность моно- и смешанных культур лактобактерий A АA A A B В СC G G

Выводы: n n Штамм E. faecium L 3 обладает антагонистической активностью in vitro к широкому спектру Грам-положительных и грамотрицательных бактерий. Более эффективно действует на псевдомонады, стрептококи группы А, листерии, нескольхо хуже на эшерихии, стафилококки, протеи и энтерококки Показано изменение (в основном увеличение) антагонистической активности E. faecium L 3 в присутствии лактобацилл (L. fermentum 65), что может рассматриваться как первый этап исследований, направленных на создание комбинированных пробиотических и пребиотических препаратов