Анализ нуклеиновых кислот Амплификация ДНК увеличение

Анализ нуклеиновых кислот

Амплификация ДНК – увеличение числа копий определённой последовательности ДНК • in vitro Полимеразная цепная реакция (ПЦР) (фрагменты длиной до нескольких тысяч п. н. ) • in vivo Молекулярное клонирование (фрагменты длиной до нескольких млн п. н. )

Молекулярное клонирование • Амплификация любых фрагментов ДНК с помощью вектора – молекул ДНК, способных автономно существовать в про- или эукариотических клетках и передаваться при их делении. • Вектор +клонируемая ДНК= РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК

Молекулярное клонирование • Идеальный вектор 1. Автономно реплицируется 2. Содержит хорошо различимые маркеры 3. Допускает встраивание чужеродной ДНК

Рестриктазы (эндонуклеазы рестрикции) – ферменты осуществляющие сайтспецифичное расщепление ДНК. В генной инженерии широко применяются рестриктазы II типа

Рестриктазы II типа узнают строго определенные короткие (4 -8 н. п. ) палиндромные последовательности ДНК и осуществляют ее расщепление.

Рестриктазы II типа могут расщеплять ДНК с образованием «липких» либо тупых концов.

РЕСТРИКТАЗЫ • Названия рестриктаз складываются из первой буквы рода микроорганизма и первых двух букв вида, из которого выделена рестриктаза. Дополнительные буквы служат для обозначения конкретного штамма или серотипа. Например, Eco. RI - фермент, выделенный из E. coli Hind. III - фермент из Haemophilus influenzae Pst. I - фермент из Providencia stuartii

Схема плазмиды p. UC 19 • Lac. Z – ген α-пептида β-галактозидазы E. coli • Amp – ген устойчивости к антибиотику ампициллину

Плазмида p. TO 3, 7 содержит вставку из регуляторной и 5’-кодирующей областей гена триптофандиоксигеназы крысы

Принцип отбора клонов, содержащих вставку в векторе p. UC β-галактозидаза катализирует реакцию: 5 -бром-4 хлор-3 -гидрокси- нерастворимый продукт индол синего цвета Вставка чужеродной ДНК в полилинкер приводит к нарушению гена lac. Z и, следовательно, синтеза β-галактозидазы. В этом случае хозяйская клетка образует бесцветные колонии, если она растет на среде с ампициллином и X-gal. Штаммы, трансформированные нерекомбинантными векторами, образуют голубые колонии на той же среде. Т. обр. , можно легко отбирать рекомбинантные (т. е. с чужеродной ДНК) колонии.

Полимеразная цепная реакция • С участием термостабильной Taq-ДНКполимеразы 1. 95℃ - плавление (денатурация, расплетание) ДНКматрицы 2. 50 -60℃ отжиг праймеров 3. 72℃ синтез ДНК • Несколько десятков циклов 95℃ 60℃ 72℃

Полимеразная цепная реакция • Детекция результатов: 1. В конечной точке : электрофорез ПЦР-продукта в агарозном или полиакриламидном геле. Качественная оценка результатов 2. В реальном времени: регистрация флюоресценции реакционной смеси, анализ накопления ПЦРпродукта Количественная оценка результатов

Полимеразная цепная реакция в реальном времени

Полимеразная цепная реакция в реальном времени • SYBR GREEN 1 – интеркалирующий краситель, специфически связывающийся с двуцепочечной ДНК

Полимеразная цепная реакция в реальном времени

Применение ПЦР • Получение препаративных количеств ДНК с нужной последовательностью • Диагностика инфекционных заболеваний • Генотипирование (криминалистика, диагностика наследственных заболеваний) • Сайт-специфический мутагенез • Изучение экспрессии генов • И др.

Электрофорез ДНК • Полиакриламидном геле (ПААГ) – для разделения молекул ДНК, различающихся длиной на 1 нуклеотид • В агарозном геле – различающихся на десятки-сотни п. н. (до нескольких тыс. п. н. ) • Пульс-форез (электрофорез в переменном электрическом поле) позволяет разделять молекулы размером до 2 млн п. н.

Электрофорез в агарозном геле Агароза обладает ярко выраженным гистерезисом: температура застывания геля (около 45℃) значительно ниже температуры плавления(около 95℃). Трехмерная сеть образуется за счет водородных связей

Электрофорез в агарозном геле Агарозные гели располагают горизонтально ( «горизонтальный» ЭФ в отличие от «вертикального» ПААГ-ЭФ). Для разделения более мелких фрагментов ДНК используют более концентрированные гели, для крупных фрагментов – менее концентрированные. Наиболее часто используют 1 -2, 5%ные агарозные гели

• Визуализация результатов электрофореза ДНК производиьтся в УФ после окраски геля интеркалирующем красителем бромистым этидием (опасно!!!канцерогенно)

Секвенирование ДНК по Сэнгеру – метод терминирующих нуклеотидов

Пиросеквенирование