АНАЛИТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Лабораторная диагностика
БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ методы исследования химических компонентов биологических жидкостей, клеток и тканей, а также процессов превращения веществ и энергии, протекающих в организме человека в норме и патологии.
Принципы Для целей клинической диагностики представляет интерес: l l l l химический состав биологических жидкостей и тканей организма изменение концентрации отсутствие одного из обычных компонентов появление необычного компонента распределение жидкости и химических компонентов между различными «структурами» организма и отдельной клетки, процессы превращения химических компонентов в целом организме или различных его органах и их регуляция с помощью медиаторов, гормонов, тканевых гормонов, ферментов; процессы обмена организма с внешней средой.
Биопробы • Исследованию подвергаются входящие в состав живых организмов неорганические, органические вещества и макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты). • Исследование может проводиться in vitro в пробах биологических жидкостей (кровь, моча, ликвор, пот, пищеварительные соки и т. д. ), патологических жидкостей (отечной, асцитической, плевральной, перикардиальной, внутрисуставной и т. д. ) или ткани, а также выдыхаемого воздуха, in vivo с помощью введенных в организм датчиков (ионоселективных электродов).
Подготовка биопроб § Состав биологических жидкостей довольно сложен, при количественном определении химического компонента обычно в качестве первого этапа исследования выделяют из биологической жидкости искомое вещество или группу близких веществ, а затем идентифицируют его по тому или иному характерному свойству и измеряют содержание – концентрацию § В ряде случаев разделение веществ, идентификация и измерение концентрации могут быть проведены одномоментно, например при исследовании биологической жидкости методом газовой хроматографии.
Принципы l В диагностической практике наибольшее распространение получили биохимические методы исследования отдельных химических компонентов, их соединений и соотношений между ними в пробах биологических жидкостей (кровь, моча и т. д. ) l В зависимости от характера исследования они могут быть разделены на качественные (обнаружение искомого вещества в пробе биологической жидкости или ткани) и количественные (определение или измерение его содержания).
Качественные методы l аналитическая химия - большей частью основаны на использовании характерного для исследуемого вещества свойства, проявляющегося при определенном химикофизическом воздействии (прибавление соответствующего реагента, нагревание и т. п. ) l Этот же принцип лежит в основе прямых количественных методов исследования.
Принципы химических, физических и физикохимических методов, применяемых при биохимическом анализе ПРИНЦИПЫ МЕТОДОВ РАЗДЕЛЕНИЯ И ВЫДЕЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ, СОДЕРЖАЩИХСЯ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
Свойство, используемое для разделения веществ и методы выделения и разделения 1. Различие температуры перехода вещества из одного состояния в другое l l перегонка - дистилляция микродиффузия изотермическая дистилляция выпаривание - высушивание сублимация
2. Различие растворимости l l l l l экстракция противоточное распределение фракционное осаждение (по видам осаждающих агентов) нейтральные соли гидрофильные органические растворители водорастворимые недиссоциирующие высокомолекулярные полимеры тяжелые металлы и их гидроокиси органические катионы анионы и полианионы иммунопреципитация
3. Различие скорости седиментации n n n седиментационный анализ центрифугирование ультрацентрифугирование при разных скоростях осаждения частиц изопикническое при зональных роторах
4. Различие величины молекул диализ при разном давлении при повышенном давлении при пониженном давлении ультрафильтрация электродиализ через нестационарную мембрану
5. Хроматография различие распределения между подвижной и неподвижной фазами (растворимости, сорбируемости, величины молекул, электрического заряда) хроматография - по виду процессов разделения n n n элюционная фронтальный анализ вытеснительная термохроматография - по принципу разделения и стационарной фазе n n n адсорбционная - твердая стационарная фаза жидкостно-адсорбционная ионообменная газоадсорбционная
Хроматография n n n n n разделительная - жидкая стационарная фаза жидкостно-жидкостная газо-жидкостная гельхроматография гельфильтрация гельхроматография по технике осуществления колоночная тонкослойная бумажная
6. Различия в электрическом заряде молекул n n n n электрофорез свободный электрофорез на носителях на бумаге - простой - высоковольтный на геле агара на геле агарозы на крахмальном геле на полиакриламидном геле - простой - дискэлектрофорез - пластинчатый на пленке ацетатоцеллюлозы на тонком слое комбинированный электрофорез+ иммунодиффузия (иммуноэлектрофорез) электрофорез+ хроматография (техника «отпечатков пальцев» )
7. Различия в электрическом заряде молекул при определенном р. Н • • • изоэлектрическое фокусирование в градиенте р. Н свободное зональное в геле иммуноэлектрофокусирование 8. Различия подвижности в электрическом и магнитном поле комплекса вещества с заряженными частицами диэлектрофорез
МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ l l l Физико-химические свойства веществ, используемые в анализе и методы определения (измерения) Экстенсивные свойства Масса (вес) Гравиметрия Объем Волюметрия Газоволюметрия Титриметрия Нейтрализационный анализ Редоксиметрия Комплексометрия, в т. ч. комплексонометрия Объемная седиментометрия
Механические свойства l l l l Плотность (уд. вес) Денсиметрия Вязкость Вискозиметрия Осмотическое давление Осмометрия Прямая осмометрия Криоскопия
Термические свойства • Температура фазовых превращений • • (плавления, кипения, замерзания) Термометрия Термогравиметрия Теплота реакций (сгорания, нейтрализации) Калориметрия Теплопроводность (газа) Термокондуктометрия
Электрические свойства l l l l Электропроводность Кондуктометрия Диэлектрическая проницаемость Диэлкометрия Импедансометрия Электроспектроскопия Абсорбционная импедансометрия
Магнитная восприимчивость • Магнитометрия • Сила диффузионного тока на электроде при реакции восстановления или окисления • Амперометрия • Полярография • При контролируемом напряжении • При контролируемом токе • При отслаивании вещества с анода • Пульсационная
Элетрометрические методы Количество электричества для реакции на электроде Кулонометрия Электродный потенциал Потенциометрия С обычными электродами С ион-селективными электродами Мембрана из специального стекла Твердая мембрана Гомогенная Гетерогенная Жидкая мембрана Ион-селективный компонент имеет заряд Ион-селективный компонент нейтрален Мембрана с закрепленным ферментом
Взаимодействие веществ с лучистой энергией l l l l l Поглощение лучистой энергии: рентгеновских лучей, ультрафиолетовых лучей, видимых лучей, инфракрасных лучей Адсорбционная спектроскопия (спектрофотометрия) Рентгеноспектрофотометрия В ультрафиолетовом свете В видимом свете В инфракрасном свете Атомно-абсорбционная спектрофотометрия Рассеяние и отражение света Нефелометрия Турбидиметрия
Преломление световых лучей (показатель преломления) • Рефрактометрия • Интерферометрия • Вращение плоскости поляризованного света • Поляриметрия • Дифракция рентгеновских лучей и электронов • Электронный парамагнитный резонанс (ЭМР) • Электронная парамагнитнорезонансная спектроскопия • Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) • Ядерная магнитнорезонансная спектроскопия • Отклонение ионизированных молекул электрическим и магнитным полем • Масс-спектрометрия
Испускание излучения n Под воздействием высокой температуры, под воздействием возбуждающего света, теплоты или химической реакции, рентгеновских лучей n Эмиссионая спектроскопия (спектрофотометрия) Фотометрия пламени Флюориметрия (измерение люминесценции и хемилюминесценции) Лазерная спектроскопия Рентгеновская флюориметрия n n
Ядерные свойства Радиоактивность n Нейтронный активационный анализ n Радиоиндикаторный анализ n Метод изотопного разведения n Сатурационный анализ n Радиоиммунологический анализ n Конкурентное связывание n
Химические свойства Скорость химических реакций Кинетические методы • При исследовании ферментов большей частью измеряют не их концентрацию, а результат проявления их каталитической активности (уменьшение содержания субстрата или увеличение содержания продукта реакции, катализируемой ферментом). • Ряд биологически активных веществ, содержащихся в организме в малых количествах (гормоны, медиаторы), выделяют тем или иным химическим способом, а измерение содержания (концентрации) производят с помощью биологических тест-объектов (изолированных органов или целых организмов экспериментальных животных), что повышает чувствительность и специфичность исследования. В последнее время эти биологические методы вытесняются радиоиммунологическими – РИА Иммуноферментными - ИФА
Комплексный подход u Совершенствование биохимических методов исследования направлено на получение наиболее точной информации о состоянии процессов обмена вещества в целом организме, в определенном органе, в отдельной клетке, в субклеточных структурах. u Они сочетаются с методами иммунологии, гистологии, цитологии и др. u Такие методы обычно сложны, трудоемки, требуют специального оборудования.
Экспресс-диагностика разработка и применение экспресс-методов максимально упрощенных по технике выполнения и быстрых методов, позволяющих в течение нескольких минут и даже секунд получить приближенную (ориентировочную) оценку определенного биохимического показателя.
Автоанализаторы l Биохимические методы исследования могут осуществляться с помощью частично или полностью механизированных систем, автоматических измерительных приборов, автоанализаторов. l технические устройства (приборы, системы приборов), предназначенные для автоматизации лабораторных исследований по определению концентрации различных веществ, скорости течения каталитических процессов, количества микрочастиц, их формы и размеров. l Современные компьютеров. анализаторы конструируют на базе
Автоанализаторы позволяют резко повысить точность исследования, пользоваться пробами меньшего объема, значительно поднять производительность труда лаборантов, обеспечить внедрение методов медицинского микроанализа в практику диспансеризации населения.
Биохимические анализаторы l l l непрерывного проточного и дискретного действия В первых исследование осуществляется в движущемся потоке проб, разделенных воздушными пробками, а во вторых — в отдельном сосуде (пробирке) для каждой пробы измерителем является фотоколориметр, а результаты измерения и порядковый номер пробы фиксируются специальным прибором.
Морфологические анализаторы Ú Кондуктометрические Ú Оптические Ú Лазерные Ú К кондуктометрическим счетчикам частиц относятся гемоцитометр кондуктометрический (ГЦМК-3), целлоскоп, прибор типа «Пикокел» и другие, устроенные по принципу «электронной калитки» . Ú Они пропускают анализируемую суспензию с частицами (например, с клетками крови) через калиброванное отверстие заведомо большего размера, чем частицы. Проходя через отверстие, частица изменяет электрическое сопротивление, а возникающие импульсы пересчитываются автоматом.
Морфологические анализаторы l l В оптических анализаторах имеются увеличительный объектив, сканирующее устройство для просмотра участка суспензии, нанесенной на предметное стекло, и фотоприемник, регистрирующий количество попавших в поле зрения частиц. Такие анализаторы более сложны и чаще используются в исследовательской практике. Оптические анализаторы позволяют определять не только количество частиц, их размеры, форму, но и получать информацию об их внутренней структуре
Лазерные анализаторы основаны на принципе светорассеяния движущимися частицами Лазерный проточный анализатор микрочастиц (АМПЛ-1) позволяет определять количество частиц, например форменных элементов крови, их распределение по размерам При помощи лазерных анализаторов можно исследовать двигательную активность клеток, например сперматозоидов, микроорганизмов и др. l
n n n выделение вещества из биологической жидкости и измерение его концентрации может быть осуществлено различными способами. Комбинации этих способов, представляющие собой конкретные методы исследования, довольно многочисленны. В отношении некоторых веществ (холестерин, холинэстераза) описано до 100 - 150 вариантов методов исследования. специфика метода исследования обусловлена характером исследуемой биологической жидкости, концентрацией изучение показателя в динамике — в течение суток (оценка нормального суточного ритма), под влиянием определенной функциональной нагрузки (выявление скрытых дефектов метаболизма), в процессе развития болезни, под влиянием лечения. комбинации диагностических тестов, отражающих ту или иную форму патологии, поражение определенного органа, глубину или стадию патологического процесса.
Применение биохимических методов исследования в диагностике предъявляет к ним особые требования: использование минимального объема биологического материала, быстрое выполнение анализа, возможность многократного применения при проведении функциональных проб, отсутствие влияния фармакопрепаратов на результаты исследования и т. д. При оценке биохимических методов исследования учитывается: правильность и воспроизводимость результатов от одного определения к другому, точность полученного результата истинному содержанию искомого вещества в пробе, специфичность - способность выявлять вещество независимо от присутствия других веществ, и предел чувствительности - наименьшее количество вещества, которое можно определить данным методом.
Разнообразие биохимических методов исследования предоставляет возможность выбора метода, оптимально соответствующего задачам и условиям клинического и научного исследования. В практической деятельности клинико-диагностических лабораторий более целесообразно использовать тщательно отобранные унифицированные методы, единые для всех лечебно-профилактических учреждений страны, что позволяет сравнивать результаты анализов, проведенных одному и тому же больному в разных учреждениях, и облегчает материально-техническое снабжение лабораторий. Отечественная номенклатура лабораторных диагностических исследований насчитывает несколько сот биохимических тестов.
ЦИТОХИМИЯ (греч. kytos вместилище, здесь — клетка + химия) n раздел цитологии, изучающий состав и распределение химических веществ в клетке и ее структурах, а также обменные процессы и химические реакции, которые лежат в основе жизнедеятельности клетки. n По целям и задачам цитохимия близка к биохимии и молекулярной биологии, а по методике исследований во многом сходна с гистохимией.
использование количественных методов исследования, позволяющих выявлять содержание отдельных веществ в клетке и ее структурах цитофотометрия и проточная цитометрия, которая позволяет получать информацию о необходимых параметрах обширных клеточных популяций с огромной скоростью (до 5 - 10 тыс. клеток в 1 сек. ) можно выделять клетки, характеризующиеся определенным свойством, например, содержанием ДНК или наличием того или иного мембранного антигена, чтобы в дальнейшем провести специальный биохимический или морфологический анализ этих клеток радиоизотопные и люминесцентные методы, методы электронной микроскопии и иммунохимии.
ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ lмикроскопические методы исследования, позволяющие проводить анализ химического состава клетки и локализации в ней исследуемых веществ при сохранении структуры клетки Их используют в цитологии, эмбриологии, патологической анатомии, физиологии, фармакологии.
Применение n n n определять характер, интенсивность обмена веществ в клетке, изучать различные специализированные функции клетки. цитохимические методы применяют для анализа отдельных клеток или их групп, обладают большей чувствительностью. От биохимических методов исследования цитохимические, отличает возможность точно определить локализацию исследуемых веществ в клетке. Цитохимический анализ, выявляя специфичность тканевых клеток, дополняет биохимические исследования. Появление цитохимических методов связано с развитием цитологии, биохимии, физиологии, аналитической и органической химии.
Методы исследования химического состава клетки подразделяют на: § физические - интерференционная, флюоресцентная и УФ-микроскопия § собственно химические, которые должны обеспечивать специфичность связывания красителя исследуемым веществом, сохранение неизменной локализации вещества в клетке в процессе подготовки и проведения исследования, окраску конечного продукта химической реакции, сохранность структур клетки в условиях ее осуществления. § качественной и количественной.
Качественные n цитохимические реакции выявляют белки и аминокислоты клетки, различные ферменты, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, пигменты, биогенные амины и неорганические вещества n Для гистохимического и цитохимического выявления белков используют их физикохимические и биологические свойства или проводят реакции на содержащиеся в них специфические группы и аминокислоты.
• К методам, использующим физико-химические и биологические свойства белков, относятся иммунохимические, авторадиографические методы, методы окрашивания, основанные на различии кислотно-щелочных свойств, методы, основанные на различиях в растворимости, методы ферментативного расщепления • К методам, использующим реакции на специфические группы белков, относятся методы определения белков по наличию реакционно-способных групп в аминокислотах • В основе цитохимические методы исследования ферментов лежит выявление продукта ферментативной реакции. Выявление самого ферментативного белка возможно лишь с помощью сложных иммуногистохимических методов • Определение нуклеиновых кислот основано на выявлении входящих в их состав различных компонентов: пуриновых и пиримидиновых оснований (по поглощению УФ-излучения), фосфорной кислоты и др. ; применяют и методы специфической ферментативной и химической экстракции.
l Для выявления углеводов используют методы их окисления, метахроматического окрашивания, связывания ионов металла, блокирования или превращения реакционно-способных групп, ферментативный гидролиз; применяют также методы авторадиографии и иммуногистохимии. Среди методов выявления полисахаридов центральное место занимает ШИКреакция. l Выявление липидов основано либо на восстановлении некоторых химических соединений жирными кислотами, либо на использовании свойства ряда красителей лучше растворяться в жировых веществах. Для выявления отдельных видов липидов часто используют комплексы различных методов. l Цитохимическое определение пигментов связано с выявлением присутствующих в их составе различных химических групп. l Биогенные амины (катехоламины и индоламины) выявляют цитохимически, используя хромаффинную и аргентаффинную реакции, реакцию окрашивания и реакцию конденсации.
n Определение внутриклеточной локализации неорганических веществ связано с большими трудностями из-за их низкой концентрации, хорошей растворимости и большой подвижности n Цитохимическое определение неорганических веществ основано на реакциях, продуктами которых являются лаки, хелаты, окрашенные соли, а также на реакциях замещения одного иона на другой. Применяют и методы микросжигания, рентгеновского микроанализа.
Количественные методы цитохимического исследования Ø Ø используют для определения содержания веществ в клетке и ее структурах. Наиболее распространенным методом количественного цитохимического исследования является цитофотометрия. Важную роль играет также авторадиография, используемая для анализа скорости синтеза и обмена веществ в клетке, определения локализации отдельных веществ, перемещения их внутри клетки, для выявления клеток, маркированных радиоактивными изотопами и др. Для выявления локализации определенных генов в хромосомах применяют метод гибридизации нуклеиновых кислот на цитологических препаратах. На предварительно денатурированную ДНК помещают радиоактивную РНК или же одноцепочечную ДНК, соответствующую структуре гена; места гибридизации обнаруживают авторадиографически.
ЦИТОФОТОМЕТРИЯ § (цитоспектрофотометрия) (греч. kytos вместилище, здесь — клетка + phos, photos свет + metreo мерить, измерять; , микрофотометрия) — цитохимический метод исследования, позволяющий определять химический состав клеток по поглощению ими света. § применяют для химического и морфологического изучения гетерогенных по свойствам, происхождению клеточных популяций, дифференциального химического анализа структур одной клетки (хромосом одного набора, ядрышка и др. ), для исследования динамики перемещения веществ в клетке и их изменений во времени, для диагностики, а также для выяснения прогноза заболевания. § Принципы цитофотометрии разработаны в 1936 г. шведским ученым Касперссоном (Т. Caspersson).
Принцип метода l При цитофотометрии через препарат пропускают пучок монохроматического света и определяют его поглощение клеткой l Цитофотометр — включает микроскоп, монохроматор, позволяющий получать излучение одной длины волны, устройство для измерения света (обычно фотоумножитель), регистратор измерений. Современные цитофотометры снабжены компьютером, видеоустройством, принтером, графопостроителем l Концентрацию исследуемого вещества вычисляют по закону Бугера — Ламберта — Вера, устанавливающему связь между поглощением света веществом, его концентрацией и толщиной слоя l Чувствительность метода — около 10 -12 г вещества структуре площадью приблизительно 1 мкм 2. в
• Точность цитофотометрии снижается вследствие неравномерного распределения вещества внутри клетки. • Для предотвращения ошибки используют сканирующую цитофотометрию — измерение оптической плотности клетки малым (диаметр порядка 0, 5 мкм) двигающимся зондом. • Цитофотометрия в УФ-области спектра позволяет определять в неокрашенных препаратах количество нуклеотидов, нуклеиновых кислот, белков по естественному поглощению ими УФ-лучей. • Более широкое распространение получила цитометрия в видимой области спектра; при этом используют естественную окраску отдельных веществ (гемоглобина, пигментов) или искусственное окрашивание препаратов гистохимическими красителями, связывающимися с химическими компонентами клетки в определенных количествах. С помощью красителей выявляют в клетке нуклеиновые кислоты, белки и их отдельные реактивные группы, а также определяют активность ряда ферментов, содержание липидов и полисахаридов.
l В результате применения цитофотометрии были получены данные о роли нуклеиновых кислот в передаче наследственных признаков, выявлена связь между изменением содержания РНК и белков в клетке и функциональным состоянием клетки (возбуждение, торможение и др. , ), установлено биологическое значение клеточной полиплоидии l Материалы, полученные с помощью цитофотометрии, способствовали формированию современных представлений о росте и регенерации тканей, клеточных механизмах гипертрофии.
Скачать презентацию АНАЛИТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Лабораторная диагностика БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
08 ММБИ - Аналитические исследования 52.ppt