Скачать презентацию Амплификация История n n n Искусственный синтез Скачать презентацию Амплификация История n n n Искусственный синтез

PCR_студенты.ppt

  • Количество слайдов: 54

Амплификация Амплификация

История n n n Искусственный синтез ДНК с использованием праймеров был описан еще в История n n n Искусственный синтез ДНК с использованием праймеров был описан еще в 1971 г. Kleppe et al. В 1983 г. Kary Mullis предложил метод, обеспечивающий накопление (амплификацию) синтезируемого фрагмента ДНК, получивший название полимеразная цепная реакция (Нобелевская премия по химии 1993 г). Принцип реакции опубликован в 1985 г Science. 1985 Dec 20; 230(4732): 1350 -4.

Распространение метода ПЦР Год Число публикаций 1985 1 1986 3 1987 8 1988 139 Распространение метода ПЦР Год Число публикаций 1985 1 1986 3 1987 8 1988 139 1989 698 1990 2 668 1995 11 890 2000 16 430 2004 20 075

Основные достоинства ПЦР Высокая чувствительность n Высокая специфичность n Проста в исполнении n Нет Основные достоинства ПЦР Высокая чувствительность n Высокая специфичность n Проста в исполнении n Нет необходимости в выделении или сложной очистке матричной ДНК n Возможность работы с практически любым биологическим материалом n

Значение для современной науки и медицины n n n n Решение самых различных научных Значение для современной науки и медицины n n n n Решение самых различных научных задач Генотипирование организмов Диагностика инфекционных заболеваний Диагностика генетических заболеваний и генетической предрасположенности Установление родства, идентификация личности Анализ древних останков, криминалистика Детекция ГМО

Репликация ДНК in vivo Новая цепь Матричная цепь Новая цепь Репликация ДНК in vivo Новая цепь Матричная цепь Новая цепь

Компоненты реакции Буфер (Tris-HCl, p. H = 8, 0 -8, 8; KCl) n Mg. Компоненты реакции Буфер (Tris-HCl, p. H = 8, 0 -8, 8; KCl) n Mg. Cl 2 (1 -3 m. M) n Праймеры (0. 4 мк. М каждого) n d. NTP (40 -200 мк. М каждого) n ДНК-полимераза (1 ед) n Матрица (1 до 1000 нг) n

Компоненты амплификационной смеси Компоненты амплификационной смеси

I. Разделение цепей (денатурация) 95°C I. Разделение цепей (денатурация) 95°C

Денатурация цепей ДНК Денатурация цепей ДНК

II. Отжиг праймеров III. Синтез ДНК (удлинение цепи) Праймер II. Отжиг праймеров III. Синтез ДНК (удлинение цепи) Праймер

Отжиг праймеров Отжиг праймеров

Синтез цепей ДНК. Синтез цепей ДНК.

2 -й цикл амплификации 2 -й цикл амплификации

3 -й цикл амплификации 3 -й цикл амплификации

Стадии ПЦР n n n Денатурация (94°C) – Обеспечивает разделение нитей ДНК Гибридизация (отжиг) Стадии ПЦР n n n Денатурация (94°C) – Обеспечивает разделение нитей ДНК Гибридизация (отжиг) праймеров на матрице (45 -65°C) – Формирует структуры узнаваемые ДНКполимеразой Синтез (удлинение) цепи (72°C) – Происходит синтез комплементарных цепей и удваивает число молекул ДНК мишени

Схема ПЦР 1 копия (матрица) Денатурация Отжиг праймеров Синтез 2 копии Схема ПЦР 1 копия (матрица) Денатурация Отжиг праймеров Синтез 2 копии

Продукты после 1 -го цикла реакции Денатурация Отжиг Синтез Продукты после 2 -го цикла Продукты после 1 -го цикла реакции Денатурация Отжиг Синтез Продукты после 2 -го цикла реакции Продукт ПЦР

Основные принципы ПЦР n n n Амплификация фрагмента происходит между двумя праймерами Амплификацию проводят Основные принципы ПЦР n n n Амплификация фрагмента происходит между двумя праймерами Амплификацию проводят в течение 30 -40 циклов Каждый цикл состоит из смены температурных режимов В реакции используют термостабильные ДНКполимеразы За 30 циклов происходит умножение амплифицируемого фрагмента ДНК в 1 000 000 раз Кинетика ПЦР характеризуется выходом на «плато»

Основные причины выхода на «плато» n n n истощение субстратов (д. НТФ и праймеров) Основные причины выхода на «плато» n n n истощение субстратов (д. НТФ и праймеров) падение активности реактантов (д. НТФ и фермента) накопление ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы конкуренция за реактанты неспецифическими продуктами или праймер-димерами концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации.

Ферменты Некоторые характеристики ДНК-полимераз Полимеразы Время полужизни при 95 С (min) Экзонуклеазная активность 5'-3' Ферменты Некоторые характеристики ДНК-полимераз Полимеразы Время полужизни при 95 С (min) Экзонуклеазная активность 5'-3' (+/-) Экзонуклеазная активность 3'-5' (+/-) Достройка 3'концов Taq 40 + - А-он Tth 20 + - A-он Pfu 120 - + blunt ends Vent 400 - + blunt ends 1300 - + blunt ends 50 - + blunt ends 120 при 100 С - + blunt ends Deep Vent Ul. Tma Pwo

Праймеры n Длина праймеров 18 -30 нуклеотидов GC-состав 45 -55%, близок к GC-составу матрицы Праймеры n Длина праймеров 18 -30 нуклеотидов GC-состав 45 -55%, близок к GC-составу матрицы Разница в температурах отжига не более 5 о. С Не должны формировать шпилек на 3 -конце n Не должны формировать димеры по 3 -концам n n n

Оптимизация ПЦР Температурный профиль реакции n Временной профиль реакции n Состав реакционной смеси n Оптимизация ПЦР Температурный профиль реакции n Временной профиль реакции n Состав реакционной смеси n конц. ионов магния конц. праймеров конц. полимеразы добавки (глицерин, ДМСО, формамид, БСА и др. )

Подбор температуры отжига Подбор концентрации ионов магния Подбор температуры отжига Подбор концентрации ионов магния

10 причин, по которым ПЦР может не идти n n n n n Плохой 10 причин, по которым ПЦР может не идти n n n n n Плохой дизайн праймеров Неверная концентрация праймеров Слишком много d. NTP или деградированные d. NTP Не перемешанный раствор Mg. Cl 2 Неверная концентрация Mg. Cl 2 Наличие ингибиторов Плохое качество минерального масла Слишком много фермента Ошибки в программе амплификатора Недостаток или избыток матрицы

Оценка результатов реакции n Электрофорез n Гибридизация с зондами Оценка результатов реакции n Электрофорез n Гибридизация с зондами

Разновидности ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR) n Touchdown (снижение T отжига) n Мультиплексная Разновидности ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR) n Touchdown (снижение T отжига) n Мультиплексная n Вложенная (nested) n In situ PCR n Reverse transcriptase (RT-PCR) n Real-time PCR (RT-PCR) n Инвертированная n

Другие методы амплификации Лигазная цепная реакция (ЛЦР, LCR) n NASBA (nucleic acid sequence-based amplification) Другие методы амплификации Лигазная цепная реакция (ЛЦР, LCR) n NASBA (nucleic acid sequence-based amplification) n Полногеномная амплификация n

Организация технологического процесса n n n Контаминация Организация лаборатории (рабочих мест) по принципу изолированных Организация технологического процесса n n n Контаминация Организация лаборатории (рабочих мест) по принципу изолированных рабочих зон Раздельное использование оборудования и принадлежностей при работе с чистыми растворами, содержащими ДНК или продукты ПЦР Обязательная постановка в каждом эксперименте отрицательного и положительного контролей Стоковые растворы разделять на аликвоты и периодически заменять

Real-time PCR Интеркалирующие красители n SYBR green Гибридизационные зонды n Taqman n Molecular beacons Real-time PCR Интеркалирующие красители n SYBR green Гибридизационные зонды n Taqman n Molecular beacons n FRET probes

Reaal-time PCR Reaal-time PCR

In situ PCR In situ PCR

Inverse PCR Inverse PCR

Asymmetric PCR Asymmetric PCR

Nested PCR Nested PCR

RAPD PCR (Random Amplification of Polymorphic DNA) RAPD PCR (Random Amplification of Polymorphic DNA)

Whole genome amplification (WGA) Неспецифичная амплификация всего генома n Конечный продукт полностью соответствует стартовому Whole genome amplification (WGA) Неспецифичная амплификация всего генома n Конечный продукт полностью соответствует стартовому материалу (в идеале…) n

Методы и история Не PCR методы: n T 7 Linker adapter PCR (Ludecke H. Методы и история Не PCR методы: n T 7 Linker adapter PCR (Ludecke H. et al, 1989) n Multiple Strand Displacement, MSD (Dean et al, 2001) PCR методы: n Primer extension pre-amplification, PEP (Zhang et al, 1992) n Degenerative oligonucleotide primer (DOP) PCR (Telenius et al, 1992)

Up to date n Genome. Plex/Omni. Plex – DOP PCR (2004) n Multiple Displacement Up to date n Genome. Plex/Omni. Plex – DOP PCR (2004) n Multiple Displacement Amplification – MSD (2006)

Genome. Plex/Omni. Plex Комбинация PEP и DOP PCR n Вырожденные олиги + универсальный адаптор Genome. Plex/Omni. Plex Комбинация PEP и DOP PCR n Вырожденные олиги + универсальный адаптор n Первый воспроизводимый WGA метод для единичных клеток n n Короткие ампликоны

Genome. Plex/Omni. Plex Genome. Plex/Omni. Plex

Multiple Strand Displacement Multiple Strand Displacement

Bacillus subtilis phage Phi 29 DNA polymerase • Оптимум работы 30 o. C • Bacillus subtilis phage Phi 29 DNA polymerase • Оптимум работы 30 o. C • Высокая хеликазная активность • Скорость 50 -200 nt/s • Процессивность 70 kb • Коррекционная активность (частота ошибок<106) • Термолабильная Blanco, L. and Salas, M. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5325 -5329)

Multiple Strand Displacement Primers Scheme for multiply-primed rolling circle amplification (Dean et al, 2001) Multiple Strand Displacement Primers Scheme for multiply-primed rolling circle amplification (Dean et al, 2001) - Random oligonucleotide primers complementary to the amplification target circle - DNA polymerase and deoxynucleoside triphosphates (d. NTPs)

Multiple Strand Displacement Primers Scheme for multiply-primed rolling circle amplification (Dean et al, 2001) Multiple Strand Displacement Primers Scheme for multiply-primed rolling circle amplification (Dean et al, 2001) - Random oligonucleotide primers complementary to the amplification target circle - DNA polymerase and deoxynucleoside triphosphates (d. NTPs) -Strand displacement DNA synthesis for more than 70 000 nucleotides without dissociating from the template

Multiple Strand Displacement Primers Scheme for multiply-primed rolling circle amplification (Dean et al, 2001) Multiple Strand Displacement Primers Scheme for multiply-primed rolling circle amplification (Dean et al, 2001) - Random oligonucleotide primers complementary to the amplification target circle - DNA polymerase and deoxynucleoside triphosphates (d. NTPs) -Strand displacement DNA synthesis for more than 70 000 nucleotides without dissociating from the template -Error rate: 1 in 106 - 107 nucleotides

Multiple Strand Displacement Multiple Strand Displacement

Сравнение методов 18 hours at 30°C 1 -10 copies of human genomic DNA 20 Сравнение методов 18 hours at 30°C 1 -10 copies of human genomic DNA 20 -30 mg product Genome. Plex 2 copies of human genomic DNA (Single Cell) 100 -200 copies of human genomic DNA 5 mg product 40 mg product

Allelic Drop out (ADO) Неизбежно при WGA c единичных клеток • Повреждение ДНК • Allelic Drop out (ADO) Неизбежно при WGA c единичных клеток • Повреждение ДНК • Распределение реагентов вблизи мишени • Чем длиннее ампликон – тем больше выпавшая область в случае срыва реакции • Короткие ампликоны – меньше потеря в случае срыва реакции, однако большие потери информации «на стыках» • В среднем, ADO = 20 -25% (для MDA и Genome. Plex)

Применение • Ограниченное количество стартового материала • PGD • Микродиссекция • Археология/антропология и т. Применение • Ограниченное количество стартового материала • PGD • Микродиссекция • Археология/антропология и т. д. • Криминалистика • Парафиновые блоки • сравнение «соседних» клеток • и т. д.

Ligase chain reaction Ligase chain reaction

Ligase chain reaction Ligase chain reaction