Amplificazione genica i sistemi commerciali Dr Claudio Piersimoni

Amplificazione genica: i sistemi commerciali Dr. Claudio Piersimoni Gruppo di Lavoro Micobatteri AMCLI Firenze, 19 -22 gennaio 2009

Parleremo di: • • Definizioni e caratteristiche Indicazioni per l’uso Performance analitiche Impatto clinico Costo-efficacia Come implementare gli attuali sistemi Controllo di qualità

I test di amplificazione diretta (DAT) • consentono il simultaneo rilevamento ed identificazione del Myc. tuberculosis complex direttamente dai campioni clinici. • i risultati sono disponibili nel giro di poche ore • non possono sostituire, ma affiancano i metodi convenzionali.

I sistemi commerciali (1) Sistema E-MTD Amplicor Probe. Tec Metodo TMA PCR SDA Bersaglio r. RNA r. DNA IS 6110 Chemioluminescenza Colorimetria Fluorimetria Assente Lettura Amplificazione e lettura C. I. A. No Si Si Licenza FDA Sì Sì No Lettura Automazione

La PCR real-time • La PCR real-time (q. RT-PCR) presenta indiscutibili vantaggi rispetto alla cn. PCR: – Rapidità – Ampio range di quantificazione del target – Riduzione della contaminazione da amplicons – Alta sensibilità intesa come più basso limite di detection

I sistemi commerciali (2) Sistema Real Art MTB PCR MTB Q PCR Alert COBAS Taq. Man DUPLICa MTB Metodo q. RT-PCT RT-PCR Target 16 S r. DNA IS 6110 16 S r. DNA 16 S-23 S r. DNA Sonda Taq. Man C. I. A. eterologo omologo Lisi-cattura Estrazione Sensibilità (n. di copie) Campioni Lisi-cattura 1 10 5 10 R R+E

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Uso autorizzato (FDA) • Campioni respiratori – Contemporanea esecuzione di microscopia e coltura – Raccolti da pazienti non trattati – Microscopia positiva per BAAR ØAmplicor ed E-MTD – Microscopia negativa per BAAR Øesclusivamente E-MTD

Algoritmo 1 MMWR 2000; 49: 593 -594

Algoritmo 2 MMWR 2000; 49: 593 -594 clinical judgment

Uso accessorio • Campioni extrarespiratori – Risultati più affidabili con: § Microscopia positiva § Aspirati gastrici, pus, biopsie – Risultati meno affidabili con: § Microscopia negativa § Liquor o altri liquidi sierosi

Uso accessorio • Diagnosi di TB in pazienti trattati su base clinica che presentino: – esame microscopico positivo – esame microscopico e/o colturale negativi • Identificazione di Myc. tuberculosis complex in colture inquinate • Ricovero in isolamento respiratorio per pazienti con sospetta TB polmonare (single first-sputum)

DAT ed isolamento respiratorio Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2008; 178: 300 -305

Modalità d’uso • Impiego mirato sulla base di un congruo sospetto clinico – clinical skills are uneven entities – di norma sul primo di tre campioni • La resa diagnostica del test dipende in larga misura da: – qualità del campione – appropriatezza della sede di prelievo

Selezione dei pazienti • Indicatori predittivi di PTB – Immigrazione – Infezione da HIV – Dimagrimento – Sudorazioni notturne – Lesioni polmonari • cavitarie • in sede apicale

Selezione dei pazienti Clinical No. of % Positive test suspicion Patients MTB culture DAT* MOTT culture High 46 89 89 2 Medium 159 20 16 0. 6 Low 56 0 3. 6 0 Van den Wijngaert et al. JCM 2004; 42: 837 -838 *; Cobas Amplicor Roche

Tempi di refertazione Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2005; 172: 1169 -1227

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I dati della letteratura • i vizi [bias] metodologici inficiano la attendibilità dei dati della letteratura • i più comuni bias possono alterare: i. accuratezza ii. specificità

Parametri metodologici JCM 2003; 41: 3233 -3240 • • • Studio prospettico eseguito in cieco Golden standard microbiologico e clinico Esclusione dei campioni raccolti da pazienti in terapia • Valutazione separata dei campioni respiratori ed extrapolmonari • Valutazione di 3 campioni a pz. per minimizzare la “uneven distribution” dei micobatteri nel campione • Sensibilità e specificità calcolate per pz. , non esclusivamente per campione

Le metanalisi (campioni respiratori) Campioni BAAR positivi Sistema Metodo Amplicor DOR Sensib. PCR 117 0. 96 0. 83 COBAS PCR 99 0. 96 Probe. Tec DSA 181 E-MTD TMA LCx LCR Campioni BAAR negativi Sensib. Specif. 77 0. 61 0. 97 0. 83 220 0. 64 0. 97 0. 98 0. 89 96 0. 71 0. 97 314 0. 97 0. 96 157 0. 76 0. 97 42 0. 96 0. 71 71 0. 57 0. 98 Thorax 2006; 61: 783 -790 Specif. DOR

Le metanalisi (liquor) DAT Eterogeneità Sens. Spec. LR + LR – DOR (p) commerciali (n. = 14) 0. 56 0. 98 35. 1 0. 44 96. 4 n. s. in-house (n. = 35) 0. 76 0. 92 11. 5 0. 21 54. 8 <0. 001 Lancet ID 2003; 3: 633 -643

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Impatto clinico dei DAT Sospetto clinico Alto Microscopia Positiva Diagnosi di TB Agevole Utilità dei DATs Limitata Alto Negativa Presuntiva Alta Basso Positiva Incerta Alta Basso Negativa Improbabile Bassa

BD Probetec ET J. Infect. 2005; 50: 187 -192

Impatto clinico dei DAT E-MTD Probabilità pre-test Numero pazienti Positività dei test: Diagnosi finale di TB (%) BAAR E-MTD Coltura Alta 46 35[2] 35 n. r. 40 (55) Intermedia 68 16[11] 15 n. r. 20 (28) Bassa 224 14[9] 10[7] n. r. 12 (17) Totale 338 65[22] 60[7] 65 72 (100) Catanzaro et al. JAMA 2000; 283: 639 -645

Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2005; 53: 195 -200 Abbott LCx

Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2005; 53: 195 -200 Abbott LCx

“Peso” nella decisione terapeutica Microscopia + + – – Sospetto clinico In In Ba Ba Al Al In In Risultato DAT Terapia Altri test + – + – Si ? Si No Si Si Si ? No Si Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1997; 155: 1497 -98

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Costo-efficacia • I test diagnostici a costo mediamente elevato possono ridurre la spesa sanitaria se: – Aumentano la accuratezza diagnostica – Riducono i tempi di degenza

Costo-efficacia dei DAT Dipende da: – No. /anno di campioni microscopico-positivi – Prevalenza di TB nei campioni microscopicopositivi – Costo giornaliero dell’isolamento respiratorio Si incrementa in caso di: – Alta prevalenza di MNT – Esecuzione dei DAT presso laboratori regionali di riferimento

Strategie di utilizzo dei DAT JCM 2008; 46: 3811 -3812 E-MTD Cost ($) per PTB suspect diagnosis % probability of correct diagnosis CDC guidelines 68. 3 0. 91 Simultaneous testing 102. 7 0. 96 Smear-positive dilution 53. 4 0. 94 Sequential dilution 90. 96 Testing strategy

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Problemi sul tappeto Falsi negativi • Diluizione del pellet • Presenza di inibitori – Controllo interno di amplificazione (CIA) • Insufficiente estrazione del target Falsi positivi • • Contaminazioni crociate Selezione dei pazienti Qual’è il gold standard ? Quali micobatteri si evidenziano ?

Caratteristiche del CIA JCM 2004; 42: 1863 -1868 • Acido nucleico – DNA plasmidico • Siti di legame dei primers – i medesimi del target • Amplicons derivati dal CIA – Differenziabili da quelli del target

Estrazione: metodi a confronto Lysis Glass fiber Extraction Phenol chloroform Adsorption Elution buffer Precipitation Ethanol Elution

Sistemi commerciali di estrazione Clin. Microbiol. Rev. 2006; 19: 165 -256 Kit Produttore Principio Formato High pure Roche Fibre di vetro Manuale QIAmp Qiagen Gel di silice Manuale Iso. Quick Orca Etanolo/tampone Manuale Mag. NA Pure Roche Silice magnetica Automatizzato Bio. Robot Qiagen Silice magnetica Automatizzato ABI Prism Applied Fibre di silicio Automatizzato Nucli. Sens bio. Mérieux Silice magnetica Automatizzato

Modifiche dei kit commerciali DAT Sample Analytical phases type Pre-testing Testing Post-testing Outcome Amplicor Respir. sample select. > specificity Amplicor Extrapul. E-MTD All E-MTD Respir. cut off values > specificity E-MTD CSF RNA extraction Probe. Tec CSF lysis cut off values >sensitivity sensitivity DNA extraction sample select. >sensitivity sensitivity IAC

Modifiche dei kit commerciali JCM 2004; 42: 5341 -5344 Metodo No. campioni addizionati di Myc. tuberculosis (cfu/ml) 6 (600) 9 (60) Altri Batteri Totale 6 (6) 6 (<1) 22 49 E-MTD 6 7 3 1[1] 0 17 [1] Quiagen E-MTD 6 [1] 9 [7] 3 [3] 3 [2] 3 24 [13] [. . ]test confermati positivi dopo ripetizione (fra 30. 000 e 499. 000 RLUs).

Modifiche dei kit commerciali JCM 2009; 47: 282 -283 st-DTB = Probe. Tec (estrazione per lisi) me-DTB = Probe. Tec (estrazione per lisi + cattura [Nucli. Sens])

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Considerazioni generali – Competenza in micobatteriologia (utilizzo per disciplina, non per tecnica) – Idoneità delle strutture – Addestramento del personale – Partecipazione a programmi di “proficiency”

Valutazione esterna di qualità Noordhoek et al. CMI 2004; 10: 295 -301 Sputum samples BCG CFU Volume (ml) 50, 000 250 6, 500 650 0 0 250 250 250 PBS samples BCG CFU 1, 000 10 0 Volume (ml) 1, 000

Valutazione esterna di qualità Noordhoek et al. CMI 2004; 10: 295 -301 Panel Amplicor LCx E-MTD Probe Tec samples Sputum 14. 7 16. 0 13. 6 12. 8 mean score PBS 4. 6 3. 3 5. 3 2. 8 mean score Total 19. 3 18. 9 15. 6 Top score available 16 6 22

I commenti degli Autori • I risultati sembrano essere influenzati più dalla tipologia degli utilizzatori che dalle caratteristiche dei metodi • Solo il 61. 2% dei campioni microscopico-negativi sono stati risposti come positivi • E’ stata riscontrata una percentuale del 4. 3% di falsi positivi

Valutazione esterna di qualità (QCMD) Anno Punteggio disponibile 2001 2002 2003 2004 2005 2006 8 24 20 20 24 20 Media In-House 7. 41 20. 5 17. 2 18. 3 19. 7 18. 4 Media Commerciali 7. 57 19. 6 16. 4 18. 1 19. 6 17. 2

Valutazione esterna di qualità (QCMD) Anno Punteggio disponibile 2001 2002 2003 2004 2005 2006 8 24 20 20 24 20 COBAS Roche 6. 7 20. 1 16. 4 19. 0 - - E-MTD 5. 3 16. 1 17. 2 19. 3 17. 6 B-D Probe. Tec 4. 8 19. 5 15. 7 17. 7 18. 5 16. 6 - - - 18. 2 20. 2 18. 4 RT Real Art

Valutazione esterna di qualità Dati INSTAND Method Mean success rates (%) 2002 2003 2004 2005 2006 COBAS Amplicor 98 91 99 98 89 Gen-Probe E-MTD 92 94 100 87 94 Probe Tec 97 98 99 98 97 In-house PCR 98 92 98 97 93

Conclusioni • Dato l’attuale costo dei DAT commerciali, è indispensabile privilegiare la appropriatezza – Utilizzo in base al sospetto clinico – Selezionando il sito più appropriato per il prelievo dei campioni da testare – Facendo attenzione alla qualità dei campioni • La sensibilità nei campioni “smear-negative” è ancora insoddisfacente • Evitare il più possibile l’uso al di fuori della indicazioni della letteratura