Александр Тышковский факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ 2011

Александр Тышковский, факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ, 2011

Что такое генетическая инженерия? • Генетическая инженерия – использование основ и методов молекулярной биологии и молекулярной генетики для конструирования организмов с заданными наследственными свойствами.

ДНК – носитель генетической информации Геном – совокупность всей ДНК клетки. Что же именно в геноме нас интересует? В случае генной инженерии это, прежде всего, гены. А что такое ген? Ген – определенный участок ДНК, кодирующий один или несколько продуктов: ДНК и/или РНК

Геномы и гены Организм Esherichia coli Saccharomyces Arabidopsis cerevisiae thaliana Drosophila melanogaster Homo sapiens Размер генома (н. п. ) 4, 6 x 106 1, 2 x 107 1, 2 x 108 3, 3 x 109 Количество генов 4000 6000 30000 13000 25000 Чемпион по размеру генома – тритон (3 x 1010 н. п. ). Одинакова ли ДНК во всех клетках нашего организма? Нет! Ведь есть спонтанные мутации и транспозоны. Чем больше геном, тем сложнее организм?

Геном человека При этом в средней клетке нашего организма хромосомная ДНК составляет 1% от всей ДНК. То есть во всей ДНК клетки хромосомных генов всего 0, 015%. Поэтому без биоинформатических методов сейчас не обойтись.

Геномы и гены Чем больше генов, тем сложнее организм? У арабидопсиса примерно 30000 генов, у человека – 25000. Значит, арабидопсис сложнее человека? Нет! Ведь есть альтернативный сплайсинг (в 94% генов человека)!

Теоретические основы генной инженерии • ДНК и РНК – носители генетической информации; • Центральная догма молекулярной биологии: ДНК – РНК – белок; • Свойства генетического кода; • Открытие плазмид; • Открытие рестриктаз; • И многое другое.

Схема типичного эксперимента 1. Получение фрагмента ДНК; 2. Конструирование in vitro рекомбинантных молекул; 3. Введение рекомбинантных молекул в клетки; 4. Отбор клонов, несущих рекомбинантную молекулу.

1. Получение фрагмента ДНК • • Химико-ферментативный синтез ДНК; Рестрикционные фрагменты; ПЦР; Синтез комплементарной ДНК (к. ДНК) из м. РНК.

Система модификации-рестрикции в бактериях • Система модификации-рестрикции – примитивный аналог имунной системы в бактериях. ДНК бактерии метилирована, поэтому не режется рестриктазами ДНК бактериофага не метилирована, поэтому разрезается рестриктазами Рестриктазы = Эндонуклеазы рестрикции

Рестриктазы II типа • В основном, узнают палиндромные последовательности:

Концы • Липкие концы на 5’-конце (фосфатный): Eco. RI 5’ G A A T T C 3’ 3’ C T T A A G 5’ • На 3’-конце (гидроксильный): Sph. I 5’ G C A T G C 3’ 3’ C G T A C G 5’ • Тупые: Sma. I 5’ C C C G G G 3’ 3’ G G G C C C 5’

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Вспоминаем репликацию ДНК! 1. Термическая денатурация двухцепочечной ДНК 2. Отжиг (гибридизация) праймеров 3. Синтез ДНК (удлинение цепи) по матрице одноцепочечной исходной ДНК Необходимы 2 праймера, фланкирующие нужный участок ДНК.

ПЦР Каждая цепь, синтезированная в ходе цикла, является матрицей для синтеза ДНК в следующем цикле. Таким образом, число продукта удваивается в каждом цикле! ПЦР легко позволяет вводить в нужный фрагмент ДНК мутацию (для этого всего лишь нужно ввести мутацию в праймер).

Синтез к. ДНК По матрице м. РНК синтезируем ДНК. Что нам для этого нужно? Вспоминаем, как это делают ретровирусы или ретротранспозоны. Используем ревертазу (обратную транскриптазу) для синтеза ДНК по матрице м. РНК (в качестве праймера – олиго(d. T)). Потом – обычную ДНК-полимеразу. Можно ли использовать праймер к ДНК?

2. Конструирование in vitro рекомбинантных молекул • Что такое вектор? Вектор (векторная молекула) – молекула ДНК, способная переносить чужеродную ДНК и обеспечивать ее поддержание в реципиентных клетках. Рекомбинатная молекула – вектор, в который чтонибудь встроилось. Какие векторы есть в природе? 1. Вирусы; 2. Плазмиды.

Плазмиды • Плазмида – кольцевая молекула ДНК бактерий, способная к автономной репликации и имеющая собственный ориджин репликации. • Плазмиды обеспечивают один из основых способов переноса генетического материала у бактерий (горизонтального переноса генов) – конъюгацию. Часто плазмиды содержат гены устойчивости к антибиотикам.

Плазмиды

Как вставить фрагмент ДНК в вектор? На помощью опять приходят рестриктазы! Разрежем фрагмент ДНК и вектор по одним и тем же сайтам рестрикции, после чего сошьем ДНК-лигазой. Чтобы вектор не замкнулся сам на себе и чтобы фрагмент ДНК встроился только в одну сторону, используют 2 разных сайта рестрикции. Какие концы лучше – липкие или тупые? Липкие! ДНК-лигазе будет куда проще их сшить (комплементарные пары концов свяжут цепи правильным образом).

Требования к векторам Вектор должен: • Автономно реплицироваться в клетках реципиента; • Не утрачивать способность к автономной репликации после вставки фрагмента ДНК; • Иметь уникальный сайт клонирования (вставки фрагмента ДНК); • Иметь селективный маркер (желательно внутри сайта клонирования).

3. Введение рекомбинантных молекул в клетки 1. 2. 3. 4. Трансформация; Электропорация; Микроинъекции; Инфицирование (вирусы и фаги); 5. Бомбардировка микрочастицами с адсорбированной ДНК.

4. Отбор клонов, несущих рекомбинантную молекулу Здесь нам понадобится селективный маркер! Лучше всего, когда их 2: один внутри сайта рестрикции вектора, другой – снаружи.

Получение трансгенных животных Ген вводят в один из пронуклеосов. Интеграция трансгена происходит случайно и может привести к нарушению экспрессии генов и быть летальной. Трансген интегрирует только в одну хромосому, поэтому трансгенное животное является гемизиготным.

Применения генной инженерии 1. Устойчивость к вредителям (ген эндотоксина, безопасный для человека, но опасный для насекомых) – вместо пестицидов!

Применения генной инженерии 2. Улучшение качества пищевых продуктов (многие растения не содержат некоторых незаменимых аминокислот (особенно лизина) и витаминов; некоторые вещества у нас не усваиваются (например, растительное железо ни в каком виде у человека не усваивается)). Получен рис, обладающий всеми этими качествами.

Применения генной инженерии 3. Животные как фармацевтические фабрики (биореакторы) на примере получения активатора плазминогена.

Применения генной инженерии 4. GFP (green fluorescent protein) – позволяет следить за судьбой белка: - в клетке - в организме - и… выйти за предел разрешения светового микроскопа!

Применения генной инженерии 5. Молекулярно-биологические методы (изучение взаимодействия белков, нуклеиновых кислот, регуляции, выделение и очистка белков и т. д. ). 6. Лекарства против вирусов (например, против СПИДа!) на основе активации апоптоза вирусными протеазами.

Применения генной инженерии 7. Генная терапия (герминальная, соматическая).

Применения генной инженерии 8. Для красоты

Применения генной инженерии 9. И многое-многое другое!

Спасибо за внимание! И добро пожаловать на факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ!