Скачать презентацию Активированная ХЛ 1 Химические активаторы 2012 Ю Скачать презентацию Активированная ХЛ 1 Химические активаторы 2012 Ю

08а_Активированная ХЛ.pptx

  • Количество слайдов: 30

Активированная ХЛ 1. Химические активаторы © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) (Sensitizers) Активированная ХЛ 1. Химические активаторы © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) (Sensitizers)

Два типа активаторов ХЛ – CL enhancers Химические активаторы – chemiluminogenic probes Вступают в Два типа активаторов ХЛ – CL enhancers Химические активаторы – chemiluminogenic probes Вступают в реакцию с образованием продуктов в электронно-возбужденном состоянии. Физические активаторы – sensitizers Не вступают в химические реакции, но увеличивают квантовый выход испускания фотона. © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Четыре активатора хемилюминесценции Химические активаторы – chemiluminogenic probes Люминол Люцигенин Физические активаторы – sensitizers Четыре активатора хемилюминесценции Химические активаторы – chemiluminogenic probes Люминол Люцигенин Физические активаторы – sensitizers Кумарины O R= N¯ H N N H O 2 Luminol-anion C-525 R= C-314 © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Robert Allen and Yury Vladimirov © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) Robert Allen and Yury Vladimirov © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Активированная ХЛ лейкоцитов O Люминол N¯ NH NH 2 O Вспышка ХЛ при добавлении Активированная ХЛ лейкоцитов O Люминол N¯ NH NH 2 O Вспышка ХЛ при добавлении стимула к нейтрофилам. 1 - без активатора, 2 – с люминолом. Число клеток: 1 = 1 106, 2 = 1 104. Чувтсвительность: 1 = 20, 2 = 1. Yu. A. Vladimirov, S. R. Ribarov, P. G. Bochev, L. C. Benov, and G. I. Klebanov. Gen. Physiol. Biophys. 9 (1): 45 -54, 1990. © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) 1 104 клеток, + люминол 1 106 клеток, без активатора

Люминол – реагент на OH и Cl. O¯ O OH N¯ HO● N · Люминол – реагент на OH и Cl. O¯ O OH N¯ HO● N · NH NH 2 O O NH N N NH O 2 Luminol-radical O¯ N O ●OO¯ N NH Luminol-anion Luminol O¯ OO¯ ¯O 2 O Luminol hydroperoxide O O O¯ + фотон N O¯ 2 Luminol-dioxide © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) O¯ O NH 2 O¯ NH O 2 3 -aminophtalate

Применение Клеточной Хемилюминесценции © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) Применение Клеточной Хемилюминесценции © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

План лекции “Клеточная хемилюминесценция” • • Введение – История – Установка – Пример кривых План лекции “Клеточная хемилюминесценция” • • Введение – История – Установка – Пример кривых ХЛ • Принцип метода – Реакции при стимуляции клеток – Активаторы свечения • – Латекс – Сульфат бария – Электропорация • Химические стимулы – – – Ca 2+ ионофоры Иммунные комплексы f. MLP FMA Поверхность апоптотических клеток Примеры применения – – • Физико-химические стимулы Активность фагоцитов Действие токсических веществ Действие света (лазера) Лекарственная несовместимость Заключение © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Photometric set of the chemiluminometer 1 2 3 4 5 © 2012 Ю. А. Photometric set of the chemiluminometer 1 2 3 4 5 © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) Tube Motor Thermostated Cuvette Shutter Photo multiplier

Выделение активных форм кислорода нейтрофилами Хемилюминесценция При взаимодействии со стимулом, например бактериями, фагоциты выделяют Выделение активных форм кислорода нейтрофилами Хемилюминесценция При взаимодействии со стимулом, например бактериями, фагоциты выделяют супероксидные радикалы и другие активные формы кислорода. 0. 05 0 0. 1 Дозы облучения 0. 15 Стимул 2 мин Время ХЛ-ответ клеток меняется после лазерного облучения. © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) 0. 2

Time course of liniimol-dependent chemiluminescence from human neutrophils Fig. 6. 15. Time course of Time course of liniimol-dependent chemiluminescence from human neutrophils Fig. 6. 15. Time course of liniimol-dependent chemiluminescence from human neutrophils, . Cells were exposed to f. Met—Leu—Phe (left-hand graph) or to phorbol myristate acetate (right-hand graph) at 37 o. C. (A) 105 cells, (B) 5 x 105 cells; (C) 106 cells. Diagram adapted from Agents and Actions, 21, 104 (1987) by courtesy of Dr C. Dahlgren and the publishers. In the left-hand curve, the first peak is probably related to extracellular events (such as HOCI production by myeloperoxidase) and the second to intracellular events. © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Стимулы • Физические – Электрические импульсы – Адгезия • Химические – Ca 2+-ионофор – Стимулы • Физические – Электрические импульсы – Адгезия • Химические – Ca 2+-ионофор – f. MLP – FMA • Физико-химические – Опсонизированный зимозан – НИЛИ © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

ХЛ нейтрофилов стимулированных латесом норма хроническая пневмония бронхиальная астма кардиосклероз ИБС гастрит мастопатия рак ХЛ нейтрофилов стимулированных латесом норма хроническая пневмония бронхиальная астма кардиосклероз ИБС гастрит мастопатия рак легкого инфаркт миокарда острая пневмония 0 2 4 6 Амплитуда вспышки ХЛ, 107 квант/с 4 p © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) 8

Измерение ХЛ цельной крови с Ba. SO 4 1 2 Кровь Ba. SO 4 Измерение ХЛ цельной крови с Ba. SO 4 1 2 Кровь Ba. SO 4 3 20 млl Эритроциты Ba. SO 4 + лейкоциты Изотонический буфер © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) Разведенная кровь ФЭУ

ХЛ ответ осажденных лейкоцитов Доноры Бронхиальная астма N =10 n=4 Острый гепатит n=8 Хроническая ХЛ ответ осажденных лейкоцитов Доноры Бронхиальная астма N =10 n=4 Острый гепатит n=8 Хроническая ИБС Хронический псориас n=6 n=18 Трофичская язва ног n=18 Лстрый псориас n=66 Туберкулез n=13 0 2 4 6 8 10 Амплитуда ХЛ ответа, отн. ед. © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) 12

Измерение электро-стимулированной ХЛ шприц Кровь 20 мкл 1 разведение крови электропоратор + термостатированная кювета Измерение электро-стимулированной ХЛ шприц Кровь 20 мкл 1 разведение крови электропоратор + термостатированная кювета 2 3 © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) ФЭУ шторка

Электростимулированная ХЛ крови Влияние амплитуды импульсов, В Амплитуда ХЛ-ответа ХЛ, отн. ед. А 500 Электростимулированная ХЛ крови Влияние амплитуды импульсов, В Амплитуда ХЛ-ответа ХЛ, отн. ед. А 500 В 6 300 4 200 2 0 0 0 2 4 6 Время, мин © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) 8 2. 5 Гиперхолестеринемия 2. 0 1. 5 1. 0 Здоровые доноры 0. 5 0 До УФ-ОК После УФ-ОК Б

Четыре активатора хемилюминесценции Химические активаторы – chemiluminogenic probes Люминол Люцигенин Физические активаторы – sensitizers Четыре активатора хемилюминесценции Химические активаторы – chemiluminogenic probes Люминол Люцигенин Физические активаторы – sensitizers Кумарины O R= N¯ H N N H O 2 Luminol-anion C-525 R= C-314 © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Хемилюминесцентная реакция люцигенина 1 e¯ eЇ 2 1 Люцигенин (двухвалентный катион-радикал катион) Luc 2+ Хемилюминесцентная реакция люцигенина 1 e¯ eЇ 2 1 Люцигенин (двухвалентный катион-радикал катион) Luc 2+ Luc+ 3 -4 photon ·O 2¯ Люцигенин диоксетан N-метилакридон Luc=O 2 N-MA Luc 2+ Luc=O 2 © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) N-MA* N-MA фотон

Хемилюминесценция при окислении ксантина 1256 – sucr-TRIS+100 mc. L lucigenin+100 mc. L xantin 1346 Хемилюминесценция при окислении ксантина 1256 – sucr-TRIS+100 mc. L lucigenin+100 mc. L xantin 1346 – + XO less than 100 mc. L 1686 – 100 mc. L lucigenin 1804 – 100 mc. L lucigenin 1926 – 50 mc. L SOD 2036 – off 450 400 350 ХЛ сигнал, м. В 300 250 200 lucigenin + xantin 150 lucigenin SOD XO 100 50 0 -50 -100 1200 1400 © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) 1600 1800 Время, с 2000 2200

Хемилюминесценция митохондрий © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) Хемилюминесценция митохондрий © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Четыре активатора хемилюминесценции Химические активаторы – chemiluminogenic probes Люминол Люцигенин Физические активаторы – sensitizers Четыре активатора хемилюминесценции Химические активаторы – chemiluminogenic probes Люминол Люцигенин Физические активаторы – sensitizers Кумарины O R= N¯ H N N H O 2 Luminol-anion C-525 R= C-314 © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Хинолизин кумарины — физические активаторы R= кумарин R= C-525 R= C-314 © 2012 Ю. Хинолизин кумарины — физические активаторы R= кумарин R= C-525 R= C-314 © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) C-334

Липидные радикалы Механизм физической активации ХЛ >C=O* f = 10 -4 © 2012 Ю. Липидные радикалы Механизм физической активации ХЛ >C=O* f = 10 -4 © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) C-525 * f = 0. 1 – 1. 0

Активация ХЛ кумарином C-525 Cemiluminescence 1000 Lipid peroxidation 100 10 Fenton’s reaction 1 10– Активация ХЛ кумарином C-525 Cemiluminescence 1000 Lipid peroxidation 100 10 Fenton’s reaction 1 10– 9 10– 8 10– 7 10– 6 10– 5 Concentration of C-525, M © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) 10– 4

Chemiluminescence (arb. Unit) Усиление ХЛ кумарином C-525. 120 A 30000 16. 8 m. M Chemiluminescence (arb. Unit) Усиление ХЛ кумарином C-525. 120 A 30000 16. 8 m. M 20 n. M 80 8 n. M 40 Fe 0 0 8. 4 m. M 20000 4. 2 m. M 10000 2+ 0 m. M 0 n. M 4 8 Time, min B 12 0 0 4 8 Time, min 1 2 Следующая презентация © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Современный хемилюминометр Smart. Lum с программным обеспечением Power. Graph a er. Optic Int Д. Современный хемилюминометр Smart. Lum с программным обеспечением Power. Graph a er. Optic Int Д. Ю. Измайлов Автор программы Power. Graph 1, 2 1 1 нм 0, 5 нм 0, 2 нм 0, 8 0, 6 0, 4 Прибор Smart Lum (www. powergraph. ru) 0, 2 0 0 20 40 60 Время (мин) 28 © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) 80 100

Действие аскорбата на кинетику Fe 2+индуцированной ХЛ липосом Опыт 0, 8 Рассчет 0, 6 Действие аскорбата на кинетику Fe 2+индуцированной ХЛ липосом Опыт 0, 8 Рассчет 0, 6 2 4 6 10 0, 4 CL intensity, arb. unit 0 15 0, 2 0 10 20 30 Time, min © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) 40 50 0 0, 4 2 4 6 10 15 0, 2 0 10 20 30 Time, min 40 50

Lycopene 0, 6 0 CL intensity, arb. unit 0, 5 0, 4 8 0, Lycopene 0, 6 0 CL intensity, arb. unit 0, 5 0, 4 8 0, 3 13, 2 0, 2 26, 4 0, 1 0 2 4 Time, min Experiment © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) 6 0 0, 5 0, 4 8 13, 2 0, 3 0, 2 26, 4 0, 1 0 2 4 Time, min Calculation 6

Вопросы к зачету 1. Клеточная хемилюминесценция. Какие клетки используются, как проводятся измерения? Основные узлы Вопросы к зачету 1. Клеточная хемилюминесценция. Какие клетки используются, как проводятся измерения? Основные узлы прибора. Форма кривых и от чего она зависит. 2. Активаторы хемилюминесценции, используемые при изучении клеток крови. Принцип их действия и специфичность. 3. Хемилюминесценция нейтрофилов крови различных групп больных. 4. Метод измерения хемилюминесценции клеток, осаждаемых на адсорбенте. 5. Электропорация клеток крови. Принцип метода и его применение. © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)