Адамның рекомбинантты ақуыздық препараттарын алу биотехнологиясы
Гендік инженерия әдістерін қолданып мүмкін болды: * адамның рекомбинанты ақуыздарының өнеркәсіптік өндірісін жүзеге асыру, *табиғи адамның ақуыздарының қасиеттері мен қызметтің жақсарту. Адамның рекомбинанты ақуыздарын биотехнология әдіспен алу кезеңдері: *рекомбинанты ақуыздың продуценттің табу, * рекомбинанты ақуыздың алу биотехнологиясын жасау.
Рекомбинанты ақуыздың микроорганизм-продуценттің табу үшін алдын ала зерттеу керек: • • Микроорганизмнің геномын; Микроорганизмнің метаболизмін; Микроорганизм патогендігін; Өнеркәсіптік өндірісінің жағдайында өсетін жағдайын, оратның құрамына кіретін компонентерін Микроорганизмнің бұл сипатамаларын тандап алынған штамм денгейде зертейді. Генетикалық әдістердің көмегімен микроорганизм штамын жақсартады. Бұл мүмкіндік береді: *микроорганизм үшін бөтен ақуыздың протеолизін төмендетуіне *бөтен и. РНҚ-ның гидролизінін төмендетуіне *геном құрамынан бөтен геннінің жоюының төмендетуіне
Рекомбинанты ақуыздарды алу негізгі технологиялық кезеңдері: • Ағза-донордың табигі нативті ДНҚ-сынан керек генді рестриктазаларды пайдаланып бөліп алу. • ДНҚ фрагментінің құрамына кіретін нуклеотидтерін анықтау. • Ие-клеткасында реплицияланатын клондау үшін пайдаланатын векторды репликазаларымен өндеу. • ДНҚ-ның екі фрагменттің ДНҚ-лигаза көмегімен байланыстыру, жаңа рекомбинанты молекуланы алу. • Ие клеткасына (реципиент-клеткаға) жасалған конструкцияны енгізу, клеткада рекомбинанты ДНК рециплицияланады да тұқымдарға беріледі (трансформация). • Рекомбинанты РНҚ енген клеткаларды идентифициялау және клеткаларды сұрыптау. Трансформацияға ұшраған клеткалары синтездейтін ерекше ақуызды алу.
Рекомбинанты интерферонды алу технологиялық сызбасы: 1. Интерферон синтезін индуциялау, одан кейін молекуласының и. РНҚ-сын бөліп алу; 2. и. РНҚ матрица негізінде к. ДНҚ-ны алу; 3. к. ДНҚ-ны рестриктаза мен лигаза ферменттердің қатысумен векторлық плазмидаға енгізу, генетикалық маркерлер бар ДНҚ және керек ақуызды кодтайтын ДНҚ бар рекомбинанты ДНҚ-ны алу; 4. Реципиенты микробты клеткаға р. ДНҚ-ның трансформациясы; 5. Интерферондың синтезін жүзеге асыратын рекомбинанты продуценттердің клондарын алу; 6. Клонды себіндіні көбейту; 7. Клеткаларды себінді сұйықтыдан центрифугалау арқылы бөліп алу; 8. Керек ақуызды бөліп алу; 9. Интерферон препараттың аффиндік хроматография әдіспен тазарту, ИНФ қарсы моноклоналды антиденелмен байланысқан сорбенті қолданады
Интерферон (ИФ ) Адамдың ИФ препараттарын көп мөлшерде алу үшін генді инженериялық әдістерді пайдаланады. - Адам ИФ -дың клонданған комплементарлы ДНҚ-сын (к. ДНҚ) E. colі клеткаларына енгізеді де экспрессиясын жүзеге асырады. - ИФ көп мөлшерде алады. ИФ генді-инженериялық әдіспен алынған препараттың вирустарға қарсы белсенділігі 10 есе төмен нативті түрімен салыстырғанда.
Генді-инженериялық әдіспен алынған ИФ молекулаларының көбісі димерлер және жоғары молекулалы белсенді емес комплекстері түрінде болады. Димер мен олигомерлер түзілетін себебі мүмкін бос SH топтары. E. colі клеткаларда бос SH топтары дисульфидтік байланыстар түзеді, ал адам клеткаларында дисульфидтік байланыстар түзілмейді. ИФ молекуласында бір немесе бірнеше цистеин кодонды басқа аминқышқылдарының қалдығына ауыстырса олигомерлер түзілмейді де белсенділігі өзгермейді. ИФ генінде 17 цистеин кодонды серин кодонына ауыстырды. E. colі клеткаларда мутанты гендің негізінде түзілген Сер-17 ИФ -дың мультимерлы комплекстері түзілмейді да белсенділігі мен тұрақтылығы қалыпты ИФ -ның сипаттамасына ұқсас болды.
Альбебетин алу тәсілі - Компьютердің қомегімен полипептидтік тізбегіндегі аминқышқылдардың тізімі құрастырылды. - Альбебетинді кодтайтын гені *химиялық синтезбен алынды, *клондалынды, *трансляциялық клеткасыз жүйеде (бесклеточная система трансляции) көбейтілді, *Е. соli себіндісінде гендің экспрессиясы жүзеге асырылды.
Альбебетин молекуласының екінші реттік құрылымы алдын ала берілген құрылымы болып табылды. Альбебетін молекуласы қайталанатын екі αββ элементтерінен құрылған Альбебетин молекуласының кеністік құрылымы *компакты, *мочевина әсеріне түрақты, *протеолиздің әсеріне түрақты. Альбебетин негізінде белгілі қызметті атқаратын бірінші жасанды белок алынды.
Альбебетин молекуласының N-соңына адамдың -интерферондың фрагменттің (131 -138 -ші а. к. ) енгізді. *жаңа белокты (альбеферон) алды. Интерферон полипептидтік тізбегінін 131 -138 -ші а. к. пептидтік бөлігі тышқан тимоциттердің бласттранформациясын активтендіреді. Альбеферон молекуласы - альбебетин қасиеттеріне ие: *компакты *түрақты. - интерферон қасиеттеріне ие *тышқандардың тимоциттердің рецепторына жоғары ұқсастығын көрсетеді, *тимоциттердің бласттрансформация реакциясын активтендіретін тиімділігі интерферондан жоғары, иммуногенді қасиеті төмен. Альбеферон құрылымы
Иммунологияның жаңа саласы – антиденелер инженериясы - керек қасиеті бар табиғи емес иммуноглобулиндерді алу. Антиденелер инженериясы екі бағытта жұзеге асады: • молекуласы толық иммуноглобулиндерді алу, • тиімді және ерекше антигенді байланыстыратын иммуноглобулиндердің фрагменттің алу. Бірінші тәсілді пайдаланып химерлы иммуноглобулинді алды – тышқан мен адам иммуноглобулиндердің бөліктерін қолданып химерлы иммуноглобулинді алды. Химерлы иммуноглобулиндің - вариабелді домендері тышқандың иммуноглобулиннен алынған, - константы бөлігі адам иммуноглобулиннен алынған.
Екінші тәсілді қолданып - “мини-антиденелердің” гендерін құрды. - гендерді E. coli клеткаларға енгізді, экспрессиясын жұзеге асырды. «Мини-антиденелер» - константы домендері жоқ антиденелер. Ферритинге қарсы «мини-антиденелерді алды. Ферритин - ісік клеткаларының маркеры. “Мини-антиденелер” - күшті иммундық жауапты ынталындырмайды, - нысана-клеткаға женіл жетеді, - организмнен тез шығып кетеді. Мини-антиденелерді маркермен немесе функционалды қосылыстармен (токсиндер, ферменттер, антибитиктер) байланыстырып нысана-клеткаға оларды тасымалдау мүмкін.
Скачать презентацию Адамның рекомбинантты ақуыздық препараттарын алу биотехнологиясы Гендік
Лекция 14 редактированный.ppt