Скачать презентацию 7 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ДИКИХ И ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ВИРУСА Скачать презентацию 7 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ДИКИХ И ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ВИРУСА

9af2b686ad4882ef1bdc01cfa7c4ee37.ppt

  • Количество слайдов: 33

7. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ДИКИХ И ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ВИРУСА КОРИ Высокая частота мутаций, типичная для 7. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ДИКИХ И ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ВИРУСА КОРИ Высокая частота мутаций, типичная для РНК-содержащих вирусов и обусловленная главным образом ошибками вирусспецифической полимеразы и отсутствием репарационных систем , ведет к появлению популяционной структуры, состоящей из большого числа микровариантов.

Попытка определения спонтанной частоты мутаций у вируса кори была предпринята С. Шраг с сотр. Попытка определения спонтанной частоты мутаций у вируса кори была предпринята С. Шраг с сотр. (Schrag et al. , 1999). В задачу исследования входило изучение частоты мутаций в Н-гене , влияющих на конформацию эпитопа , взаимодействующего с моноклональным антителом Mab 80 -III-B 2. При этом был использован флюктуационный тест, разработанный Луриа и Дельбрюком (Luria and Delbruck , 1943).

В течение последних десятилетий накопились факты , свидетельствующие о наличии вариабельности биологических свойств среди В течение последних десятилетий накопились факты , свидетельствующие о наличии вариабельности биологических свойств среди диких и вакцинных штаммов вируса кори. В частности, хотя вирус кори рассматривается как относительно стабильный в антигенном отношении вирус (монотипический вирус), имеются сообщения о наличии заметных антигенных вариаций , определяемых с помощью моноклональных антител (Sheshberadaran and Norby, 1986; Tamin et al. , 1994. . ).

Были описаны варианты вируса кори , которые агглютинируют эритроциты только в присутствии высоких концентраций Были описаны варианты вируса кори , которые агглютинируют эритроциты только в присутствии высоких концентраций ( 0, 8 M) сульфата аммония. Некоторые коревые изоляты неожиданно оказались такими солезависимыми вариантами (Gould et al. , 1976; Shirodaria et al. , 1976). Молекулярный механизм этого феномена остается неясным, однако результаты исследований д-ра Фланагана и д-ра Римы ( Flanagan and Rima неопубликованные данные) показывают, что у соле‑зависимых вариантов имеются в Н-белке аминокислотное замещение F- L в позиции 117.

Особого внимания, заслуживает антигенная вариабельность вируса кори. Чтобы оценить потенциальные иммунологические последствия наблюдаемых изменений Особого внимания, заслуживает антигенная вариабельность вируса кори. Чтобы оценить потенциальные иммунологические последствия наблюдаемых изменений поверхностных гликопротеинов диких штаммов вируса кори, циркулирующих в настоящее время в природе, были детально исследованы образцы сывороток от вакцинированных лиц и коревых больных (Tamin et al. , 1994).

Попытки картировать эпитопы на поверхности Н- белка с использованием синтетических пептидов в большинстве своем Попытки картировать эпитопы на поверхности Н- белка с использованием синтетических пептидов в большинстве своем оказались безуспешными. Только антисыворотка к пептидам , соответствующим последовательности аминокислот 185 - 195, которая консервативна у всех диких штаммов, исследованных до настоящего времени, обнаруживала нейтрализующую активность.

Таким образом , роль антигенных изменений Н-белка в эпидемиологии коревых инфекций до сих пор Таким образом , роль антигенных изменений Н-белка в эпидемиологии коревых инфекций до сих пор остается неясной. Существующие в настоящее время дикие штаммы вируса кори хорошо нейтрализуются антителами, индуцируемыми вакцинными штаммами, и эти вакцинные штаммы весьма эффективны в предотвращении заболеваний. Возможно, однако, что антигенные изменения в Н – белке диких штаммов вируса кори в комбинации с убывающей иммуногенностью вакцинных штаммов будут способствовать в будущем распространению диких штаммов среди высоковакцинированного населения.

Группа японских исследователей сообщила о получении мелкобляшечного варианта вируса кори со сниженной вирулентностью для Группа японских исследователей сообщила о получении мелкобляшечного варианта вируса кори со сниженной вирулентностью для новорожденных мышей (Sakae et al. , 1997). Вариант был селекционирован в результате пассирования штамма Edmonston в клеточной линии NIH 3 T 3 в течение 5 –ти месяцев. В процессе пассирования данного варианта на клетках NIH 3 T 3 не отмечалось наличие цитопатогенного эффекта, однако на клетках Vero полученный вариант имел титр около 2 х 100000 БОЕ/мл.

 В последние годы генетическая изменчивость диких штаммов вируса кори стала объектом самого интенсивного В последние годы генетическая изменчивость диких штаммов вируса кори стала объектом самого интенсивного изучения в связи с обнаружением заметного генетического дрейфа этих штаммов после широкого распространения коревых вакцин. Генетические изменения были обнаружены в кодирующей части Н, F, N, P и М --генов. Наибольшая степень вариабельности среди диких штаммов вируса кори, как уже указывалось, была найдена в СООН- концевом участке N- белка протяженностью в 151 аминокислотный остаток. (Taylor et al. , 1991; Rota et al. , 1994 a ; Rota et al. , 1994 b).

Подъем заболеваемости корью в США в 1988 - 1991 гг. во многом объясняют изменениями Подъем заболеваемости корью в США в 1988 - 1991 гг. во многом объясняют изменениями в гене, кодирующем гемагглютинин у диких штаммов вируса кори, циркулирующих в это время в этой стране ( Rota et al. , 1992). Было обнаружено, что Н- белок этих штаммов отличался от Н- белка вакцинного штамма Moraten в 19 позициях и включал еще один дополнительный сайт гликозилирования ( Rota et al. , 1992).

Анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих N- белок 15 диких штаммов вируса кори, выделенных в период Анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих N- белок 15 диких штаммов вируса кори, выделенных в период с 1954 по 1990 гг. , и одного из вакцинных штаммов показал, что N- гены отличались по 76 нуклеотидным позициям ( 4, 75%) и 18 аминокислотным позициям (3, 42%). Нуклеотидные замены были распределены по всей длине N- гена, однако в пределах СООН-концевой части гена длиной 456 нуклеотидов последовательности этого гена отличались в 38 позициях ( 8, 3% ).

 Интересно отметить, что дикие штаммы, циркулирующие в этот период в США и Канаде Интересно отметить, что дикие штаммы, циркулирующие в этот период в США и Канаде были более родственны диким изолятам, выделенным в Великобритании между 1983 и 1988 гг. , чем штаммы BER 83 и BOS 83, которые были выделены в США в 1983 г. Эти наблюдения позволяют предположить, что штаммы BER 83 и BOS 83 могут соответствовать тупиковой исчезающей линии диких штаммов вируса кори.

Еще одна заметная генетическая линия диких штаммов вируса кори включала изоляты из двух стран Еще одна заметная генетическая линия диких штаммов вируса кори включала изоляты из двух стран Западной Африки: Габона и Камеруна, выделенные в 1983 - 1984 гг. Дикие штаммы , выделенные в США в конце 50 -х годов, дикие штаммы Edmonston и PH 26, штамм HAL, выделенный в Финляндии, были близкородственны вакцинному штамму Moraten и образовывали еще одну генетическую линию ( Rota et al. , 1994 a). Часть этой группы в N- гене имели различия только в 9 –ти нуклеотидных позициях (0, 6%) и в 3 -x аминокислотных позициях (0, 6%).

 Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей М-гена небольшого числа диких штаммов, циркулирующих с 1954 по Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей М-гена небольшого числа диких штаммов, циркулирующих с 1954 по 1991 г. показал, что М-ген несколько более был консервативен на нуклеотидном уровне по сравнению с N-геном. M- гены исследованных штаммов отличались по 36 нуклеотидным позициям ( 2, 6 %) и по 8 аминокислотным позициям ( 3, 3%). Было обнаружено, что аминокислотные изменения в М-белке концентрируются на N- конце. Между 50 -ым и 100 -ым аминокислотными остатками наблюдалось наибольшее количество замен.

Существование множественных генетических линий диких штаммов витруса кори было доказано после анализа N, P, Существование множественных генетических линий диких штаммов витруса кори было доказано после анализа N, P, и М- генов диких штаммов, циркулирующих в разные периоды времени ( Baczko et al. , 1991; Baczko et al. , 1992; Taylor et al. , 1991; Rota et al. , 1994 a). Полученные данные еще раз подтверждают вывод , что до широкого распространения коревых вакцин в 1960 г. дикие штаммы вируса кори были генетически гомогенны и могли существовать как единственная генетическая линия.

 Дальнейшие исследования в этом направлении были предприняты группой Рима с сотр. ( Rima Дальнейшие исследования в этом направлении были предприняты группой Рима с сотр. ( Rima et al. , 1997). C этой целью был предпринят детальный филогенетический анализ Н-генов 75 диких и вакцинных штаммов вируса кори. Анализ последовательностей СООН –концевой части N- гена 36 штаммов вируса кори показал значительную дивергенцию этого участка как на нуклеотидном ( 7, 2%), так и на аминокислотном уровне (10, 6%) (Taylor et al. , 1991).

Согласно классификации Тейлора первая генетическая линия ( группа А) содержала все вакцинные штаммы, используемые Согласно классификации Тейлора первая генетическая линия ( группа А) содержала все вакцинные штаммы, используемые в настоящее время. Типичным представителем этой группы является штамм Edmonston. Эта группа содержит и ранние американские изоляты, как, например, PH 26 , штамм Turku, выделенный в Финляндии в 1962 г. Эта группа кроме того включает в себя штаммы Нalle, Mantooth и Horta-Barbosa, изолированные от больных, страдающих ПСПЭ.

 Генетические линии могут состоять из нескольких генотипов , отражающих местные особенности той или Генетические линии могут состоять из нескольких генотипов , отражающих местные особенности той или иной генетической линии. Данные, собранные в США между 1989 и 1999 гг. ясно показывают, что прекращение передачи местного генотипа D 3 было достигнуто в 1993 г. Секвенирование генома местных штаммов подтвердило, что вирусы кори , изолированные с 1993 г. , были членами генотипов С 2, D 4, D 5, D 6 и были импортированы в США из других регионов планеты. В 1993 г. был отмечен первый документированный занос в США генотипа D 4 из Индии.

 Ген, кодирующий Н-белок у диких штаммов вируса кори, как уже отмечалось, отличается большим Ген, кодирующий Н-белок у диких штаммов вируса кори, как уже отмечалось, отличается большим разнообразием. Поскольку Н -белок является главным иммуногеном, индуцирующим образование новых нейтрализующих антител, его вариабельность является результатом иммунологического давления на этот белок. Группой Рима с сотр. ( Rima et al. , 1997) был предпринят филогенетичсский анализ Н-генов 75 диких и вакцинных штаммов вируса кори (32 опубликованных последовательности и 43 новых последовательности).

Имеется весьма незначительная информация относительно функций и генетической вариабельности первичной структуры межцистронной области генома Имеется весьма незначительная информация относительно функций и генетической вариабельности первичной структуры межцистронной области генома вируса кори, расположенной между кодирующими участками М- и F- генов вируса кори. Эта область включает 3 -нетранслируемый локус М-гена ( 429 н. ), межгенный участок (3 н. ) и 5 - нетранслируемый локус F- гена (573 н. ). Первичная структура 3 - нетранслируемого локуса М- F области генома вируса кори была исследована Беллини с сотр. ( Bellini et al. , 1986).

Также было показано, что нуклеотидная последовательность 5 - нетранслируемого локуса F-гена содержит несколько потенциальных Также было показано, что нуклеотидная последовательность 5 - нетранслируемого локуса F-гена содержит несколько потенциальных инициирующих кодонов, два из которых расположены в позициях 574 и 583. Продемонстрировано, что трансляция F- белка обычно осуществляется с AUG 2 - кодона в позиции 583. В отсутствие некодирующего локуса трансляция инициируется либо с AUG 1 либо с AUG 3 - инициирующих кодонов (Cathomen et al. , 1995).

Детальный анализ вариабельности некодирующей М-F области генома был недавно проведен у штаммов вируса кори, Детальный анализ вариабельности некодирующей М-F области генома был недавно проведен у штаммов вируса кори, входящих в генетические линии A, B, D, H (Markushin et al. , 1997). Проведенный анализ показал , что степень вариабельности М-F области у диких штаммов вируса кори , принадлежащих к различным генетическим линиям, была необычайно высокой.

Было обнаружено, что уровень генетической вариабельности М-F области генома во всех без исключения случаях Было обнаружено, что уровень генетической вариабельности М-F области генома во всех без исключения случаях отражал уровень вариабельности других кодирующих и некодирующих участков генома вируса кори. Характер распределения нуклеотидных замещений в нуклеотидной последовательности М-F области генома при сравнении штаммов, относящихся к различным генетическим линиям не позволяет идентифицировать сколько-нибудь протяженные консервативные участки в пределах данной области генома, что свидетельствует в пользу того, что эта область генома не имеет участков с уникальной вторичной структурой, выполняющей регуляторные функции.

Анализ нуклеотидных последовательностей N -гена 38 изолятов, выделенных в Германии, Чехии, Дании, Польше и Анализ нуклеотидных последовательностей N -гена 38 изолятов, выделенных в Германии, Чехии, Дании, Польше и России был предпринят сотрудниками Института Р. Коха в Берлине (Santibanez et al. , 1999). Был проведен анализ СООН-концевой части гена, включающей 285 нуклеотидов. Было обнаружено, что в Германии в период между 1993 и 1996 гг. циркулировало два генотипа С 2 и D 6, входивших, соответственно в генетические линии С и D. Изоляты генотипа С 2 были родственны штаммам, выделяемым в Германии до 1993 г.

 Анализ нуклеотидных последовательностей СООН- концевой части N-гена диких штаммов, циркулирующих в европейской части Анализ нуклеотидных последовательностей СООН- концевой части N-гена диких штаммов, циркулирующих в европейской части России в 2000 -м году, показал, что все они относятся к генотипу D 4 ( генетическая линия D) (Markushin et al. , manuscript in preparation).

Интересно отметить, что штамм Nepal, относящийся к генотипу D 4, был выделен в 1997 Интересно отметить, что штамм Nepal, относящийся к генотипу D 4, был выделен в 1997 г. на юге Непала. Как известно, Н-ген вируса кори содержит 5 потенциальных мест гликозилирования с N-связями. Они локализуются в аминокислотных остатках 168, 187, 200, 215, 238. Дополнительное место гликозилирования было обнаружено в позиции 416 Н-белка. Штамм Nepal имел в Н- белке мутации в позициях 169 ( S-A) и 211 ( G-S) при сравнении со штаммом Edmonston ( Lingyun and Yipeng. , 1998).

Интересные данные были получены в отношении генетической вариабельности диких штаммов вируса кори , циркулирующих Интересные данные были получены в отношении генетической вариабельности диких штаммов вируса кори , циркулирующих в 1992 - 1995 гг. в Великобритании (Jin et al. , 1997). При изучении 50 изолятов, выделенных в этой стране, было обнаружено 3 отдельных генотипа, которые были близкородственны генотипам , описанным прежде в США и континентальной Европе. Как оказалось, генотип 1 соответствовал генотипам D 1 и D 3 генетической линии D, генотип 2 -генотипу С 2 генетической линии С, и генотип 3 - генотипу D 2 генетической линии D.

 Секвенирование части Н-гена 18 диких коревых штаммов, изолированных в Гамбии в период 1994 Секвенирование части Н-гена 18 диких коревых штаммов, изолированных в Гамбии в период 1994 - 1995 гг. показало высокую степень гомологии ( > 98, 5%). Эти последовательности образовывали кластер, характерный только для данного географического района. Общей чертой этих изолятов было наличие трех характерных мутаций в Н-гене в позиции 7963, 8649 и 8653, не наблюдаемых в Н-гене изолятов из других географических районов (Outlaw et al. , 1997).

 На основании филогенетического анализа и анализа полиморфизма рестриктазных фрагментов H и N- генов На основании филогенетического анализа и анализа полиморфизма рестриктазных фрагментов H и N- генов диких штаммов вируса кори, циркулирующих в западной части Японии , эти дикие штаммы были распределены в два генотипа. Было показано, что в течение 10 лет штаммы, относящиеся к одному генотипу, полностью заменили штаммы, относящиеся к другому генотипу ( Katayama et al. , 1997).

 В южной Африке эволюция вируса кори была исследована в условиях начальной стадии противокоревой В южной Африке эволюция вируса кори была исследована в условиях начальной стадии противокоревой вакцинации (Kreis et al. , 1997). Были проанализированы последовательности СООН- концевой части N- гена 20 изолятов, часть из которых была выделена в 1988 - 1989 гг. , а другая часть- в 1994 -1995 гг. Было обнаружено, что по крайней мере существует несколько различных генетических групп диких коревых штаммов , из которых одна циркулирует с 1986 г. Генотип , включающий основную массу изученных штаммов, выделенных в более позднее время, характеризовался тремя специфическими мутациями в N-гене.

В отдельных регионах Европы в настоящее время продолжаются отдельные коревые вспышки благодаря недостаточной вакцинации. В отдельных регионах Европы в настоящее время продолжаются отдельные коревые вспышки благодаря недостаточной вакцинации. В Люксембурге в 1996 г. была отмечена коревая вспышка с охватом 110 человек и сообщения о заболеваниях корью в этой стране продолжались до 1997 г. Молекулярно-генетический анализ показал , что все изоляты относятся к генотипам С 2 и D 6. Дивергенция в данном конкретном случае достигала 0, 2%.

 З А К Л Ю Ч Е Н И Е Молекулярно- генетические исследования З А К Л Ю Ч Е Н И Е Молекулярно- генетические исследования вируса кори, проведенные в последнее время, позволили значительно продвинуть вперед наше понимание структуры генома этого вируса, особенностей отдельных стадий его внутриклеточного цикла репродукции и его природной изменчивости.

Вместе с тем некоторые вопросы молекулярной генетики вируса кори продолжают оставаться малоизученными. В частности Вместе с тем некоторые вопросы молекулярной генетики вируса кори продолжают оставаться малоизученными. В частности продолжают оставаться непонятными функция и роль некодирующей М-F области генома этого вируса. Остаются невыявленными “истинные ” клеточные рецепторы в человеческом организме, которые взаимодействуют с вирусом в процессе обычной коревой инфекции.