69 АППАРАТ ТРАНСЛЯЦИИ Особенности структуры т. РНК «клеверный лист» L-конфигурация Акцепторами для одной и той же аминокислоты могут служить несколько разных т. РНК (изоакцепторные т. РНК), имеющих разные антикодоны, что позволяет им спариваться с кодонами-синонимами.
70 Образование аминоацил-т. РНК Aminoacyl t. RNA synthetase for aspartic acid (Class II aa. RS). It is a dimer of two identical subunits (blue and green); t. RNA molecules are shown in red.
71 Состав рибосом Прокариоты (L 1 -34) Эукариоты (S 1 -21) Selected views of the 70 S ribosome of E. coli as obtained by cryo-electron microscopy of single ribosomes and reconstruction using 4300 projections (Frank et al. , Nature 376 (1995) 441 -444). Yellow: 30 S subunit, blue: 50 S subunit.
72 Строение рибосом P A E К анимации: 5 S(50 S) - желтый; 23 S(50 S) и 16 S(30 S)-красный; белки - синие каталитический аденин (50 S)-зеленый
73 Особые т. РНК и некоторые вспомогательные белки, участвующие в трансляции Как у про-, так и у эукариот имеются два вида т. РНК, которые связывают метионин. У прокариот они обозначаются как т. РНКMet. F и т. PHKMet. M, а у эукариот т. РНКMet. I и т. РНКMet. M. Известны белки, которые только временно, на период трансляции, связываются с рибосомами. К ним относятся: факторы инициации IF-1, IF-2 и IF-3 факторы элонгации EF-Tu и EF-Ts, EF-G факторы «освобождения» RF-1, RF-2 и RF-3 комплекс EF-Tu - т. РНК
74 ТРАНСЛЯЦИЯ м. РНК У ПРОКАРИОТ Полипептидные цепи синтезируются однонаправленно: с N-конца к C-концу. При этом карбоксильная группа уже образовавшегося участка полипептидной цепи соединяется с аминогруппой следующей присоединяемой аминокислоты пептидной связью. Трансляция продолжается в направлении 5' → 3' до тех пор, пока не достигнет стоп-сигнала, расположенного сразу же за кодоном, детерминирующим С-концевую аминокислоту
75 ИНИЦИАЦИЯ ЭЛОНГАЦИЯ ТЕРМИНАЦИЯ Инициация трансляции При связывании IF-1 и IF-3 с 30 S-субчастицей происходит диссоциация 70 S-рибосомы IF-3 обнаружен не у всех бактерий, но у E. coli он необходим для связывания 30 S с м. РНК в инициаторном сайте. IF-2 способен узнавать f. Met-РНКMet. F, но не Met-т. РНКMet. M IF-1 связывается с 30 Sсубчастицей в А сайте и препятствует входу аминоацил-т. РНК в P-сайт, увеличивает сродство IF-2 к рибосоме
76 Инициация трансляции Богатая пуринами последовательности из пяти-восьми нуклеотидов, последовательность Шайна-Дальгарно или SD-последовательность
77 Элонгация полипептидной цепи На рибосоме три сайта связывания т. РНК (Peptidyl) (Exit) (Aminoacyl)
78 Элонгация полипептидной цепи Связывание аминоацил-т. РНК в А-сайте и освобождение т. РНК из Е-сайта
Structures of the ribosome associated with elongation factors, and apo-form crystal structures of elongation factors (b) The ribosomal RNAs are colored gray, the 50 S subunit proteins are colored green, and the 30 S subunit proteins are colored dark blue. The P-site t. RNA is shown in light blue, and the E-site t. RNA is shown in yellow as surface representations. (b) Left, the Thermus aquaticus EFTu·GDPNP·Phe-t. RNAPhe complex (PDB 1 TTT) (EFTu, elongation factor Tu); right, Thermus thermophilus EF-G·GDP (PDB 1 DAR) (EF-G, elongation factor G). (c) Structure of EF-Tu and aminoacyl-t. RNA bound to the ribosome. Overall view of the complex, with EF-Tu and t. RNAs. Note that aminoacyl-t. RNA (orange) bound to EFTu (purple) is in the ‘A/T state’. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2011. 2(5): 647 -68 (d) EF-G in the posttranslocational state of the ribosome. Overall view of EF-G (purple) on the ribosome.
79 Терминация синтеза полипептидной цепи Сигналом терминации служат терминирующие (стоп, «nonsense» ) кодоны м. РНК UGA - amber UAG - opal UAA - ochre Факторы терминации (release factors) RF-1 узнает UAA или UAG RF-2 узнает UAA или UGA RF-3 облегчает работу RF-1 и RF-2 1. RF-1 или RF-2 вместо т. РНК связыватся с кодоном в сайте A 2. Пептидилтрансфераза катализирует реакцию молекулы воды с активированной пептидной цепью 3. Полипептидная цепь освобождается 4. т. РНК и м. РНК освобождаются 5. 50 S и 30 S субчастицы диссоциируют
t. RNA mimicry in translation termination and beyond Yoshikazu Nakamura and Koichi Ito (RF 3) (RF 1, RF 2) Wiley Interdiscip Rev RNA. 2011. 2(5): 647 -68 Essential steps in translation. The 30 S (blue) and 50 S (green) subunits harboring the decoding center (DC) and peptidyl-transferase center (PTC), with the m. RNA (yellow) bound to the 30 S subunit. The three different positions for t. RNA molecules are indicated as the A, P, and E sites. In the elongation cycle, the incoming aminoacyl-t. RNA is delivered to the empty A site of the ribosome as a ternary complex with elongation factor Tu (EF-Tu; purple) and GTP. After GTP hydrolysis, the peptidyl-t. RNA in the P site donates its growing polypeptide to the amino acid on the t. RNA in the A site. The newly formed peptidyl-t. RNA is then translocated from the A to the P site. Simultaneously, the deacylated t. RNA in the P site is moved into the E site. Protein synthesis terminates when a stop codon enters the DC of the ribosome. Release factor (RF; red) binds to the empty A site of the termination state of the ribosome, with a deacylated t. RNA in the E-site and a peptidyl-t. RNA in the P-site, recognizes the stop codon, and triggers peptidyl-t. RNA hydrolysis.
Recognition of the stop codon in the decoding center by RF 1 and RF 2 Recognition of the stop codon in the decoding center (DC) by RF 1 and RF 2. (a) RF 1 (the PVT motif) reading UAA (PDB code: 3 D 5 A). (b) RF 1 (the PVT motif) reading UAG (PDB code: 3 MR 8). 39 (c) RF 2 (the SPF motif) reading UAA (PDB code: 3 F 1 E). 31 (d) RF 2 (the SPF motif) reading UGA (PDB code: 2 WH 1).
80 ТРАНСЛЯЦИЯ ИНИЦИАЦИЯ ЭЛОНГАЦИЯ ТЕРМИНАЦИЯ После трансляции кодирующей последовательности рибосомы начинают новый раунд. Диссоциация субчастиц контролируется фактором инициации IF-3 совместно с IF-1, которые таким образом осуществляют общий контроль уровня белкового синтеза.
81 ОБЩИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССА ТРАНСЛЯЦИИ Одновременная трансляция молекулы м. РНК более чем одной рибосомой Образование полирибосомы. После того как одна рибосома удалится из сайта инициации на расстояние 100 -200 нуклеотидов, следующая образует инициаторный комплекс в том же сайте и начинает трансляцию
82 Трансляция бактериальных м. РНК осуществляется параллельно транскрипции
Взаимодействие кодона и антикодона. Неоднозначное соответствие т. РНКTyr (3’) т. РНКTrp (5’) 83 т. РНКSer 1 т. РНКSer 2 т. РНКSer 3 т. РНКLys т. РНКGlu
84 Неоднозначное соответствие 1. Некоторые аминокислоты могут доставляться к рибосоме несколькими типами т. РНК, имеющими разные антикодоны. В тоже время другие аминокислоты доставляются к рибосоме только одной т. РНК. 2. Некоторые типы т. РНК могут доставлять их специфическую аминокислоту распознавая несколько кодонов, что является следствием потери специфичности спаривания нуклеиновых оснований на одном конце кодона и антикодона. Такое “небрежное” спаривание получило название неоднозначное соответствие или “качание” (wobble). Wobble rules (Ser) U, С, A, G - четыре обычных основания РНК; Нх - дезаминированная форма аденина - гипоксантин
85 Неоднозначное соответствие (3’) (5’) т. РНКTyr т. РНКTrp т. РНКSer 1 т. РНКSer 2 т. РНКSer 3 т. РНКLys т. РНКGlu
Мутации в кодонах и антикодонах 86 AUC CUA ААА UCU GUA AUA CAG AUG GGC Ile-Leu-Lys-Ser-Val-Ile-Gln-Met-Gly. AUC CUA UAA UCU GUA AUA CAG AUG GGC Ile-Leuнонсенс-мутация Трансляционная супрессия терминирующих кодонов Трансляционная супрессия миссенс-мутаций
87 ТРАНСЛЯЦИЯ м. РНК У ЭУКАРИОТ Транскрипция и трансляция м. РНК прокариот Транскрипция, процессинг и трансляция м. РНК эукариот
136 Структура эукариотической м. РНК Последовательность Козак 7 -метилгуаниловая кислота (кэп) Первичный транскрипт Наиболее консервативные основания, окружающие стартовый кодон в структуре различных м. РНК человека.
136. 5 Каноническая инициация трансляции у эукариот Схема предполагаемого расположения факторов инициации на 40 S рибосомной субчастице. Вид со стороны головки. Номера соответствуют номенклатуре факторов инициации (e. IF). Составлено по данным криоэлектронной микроскопии. Модель сканирования, основанная на предотвращении обратного движения инициаторного комплекса путем циклического связывания фактора e. IF 4 B с м. РНК. Успехи биологической химии, т. 52, 2012, с. 127–
136. 6 ДЛЯ ТОГО, ЧТОБЫ ПОЛУЧИТЬ БЕЛОК, НУЖНО ОБЕСПЕЧИТЬ ТРАНСКРИПЦИЮ И ТРАНСЛЯЦИЮ ГЕНА +1 P SD ATG CDS STOP tt RBS Схема кассеты для экспрессии белка в клетках прокариот P – промотор +1 – точка начала транскрипции SD – последовательность Шайна-Далгарно (Shine-Dalgarno) ATG – инициаторный кодон RBS – сайт связывания рибосомы (ribosome binding site) CDS – кодирующая последовательность ДНК (coding DNA sequence) STOP– терминирующий кодон tt – терминатор транскрипции
Скачать презентацию 69 АППАРАТ ТРАНСЛЯЦИИ Особенности структуры т РНК клеверный
lec_5.ppt