52a78cb6657e47749b26d07e8e8f06fb.ppt
- Количество слайдов: 36
30 сентября -2 октября 2015, КВЦ «Сокольники» , Москва, СОВРЕМЕННАЯ ДИАГНОСТИКА ИНВАЗИВНЫХ МИКОЗОВ В ГРУППАХ ПОВЫШЕННОГО РИСКА Багирова Наталия Сергеевна ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» МЗ РФ, Москва E-mail: nbagirova@mail. ru 1
ИГИ [CDC, 2013 hptt: /www. cdc. gov/fungal ]: • КАНДИДОЗ (8 -10 сл. /100 000); НКИ 3400 ИК /год в США с лет. 220 больных. +6000 -29000 $, + 3 -13 дней доп. госпит. • АСПЕРГИЛЛЕЗ (1 -2 сл. /100 000) • ЗИГОМИКОЗ (1, 7 сл/1 000) • ФУЗАРИОЗ (летальность 90 -100%) • КРИПТОКОККОЗ (0, 4 -1, 3 сл/100 000, летальность 12%) 90% • ПНЕВМОЦИСТОЗ (летальность 5 -40% лечение+; 100% - лечение-) Багирова Н. С. 2
Динамика частоты выделения грибов из крови онкогематологических больных (ФГБУ «РОНЦ им. Блохина» МЗ РФ: онкогематология, 2015; 8(2): 192– 201) Багирова Н. С. 3
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ ИГИ в клинике [Kriengkauykiat J. , Review. Clin. Epidemiol. , 2011] ] Группы больных ТГСК ИС 28% ИА 43% Зиго прочие микоз 8%-9% 15% Трансплантаци 52, 9% 18, 8% 2, 3% (3) 19% я солидных органов онкогематологи 13, 5 -44% 33 -69% 44% нд я Отделение 79% 11% нд 10% интенсивной терапии Багирова Н. С. 4
Какие онкологические больные нуждаются в грибковом мониторинге? Критерии отбора Нейтропения <5 -10 дней Солидные опухоли Лимфома/миелома ауто. ТСГК Цитостатическая терапия при ОЛ, нейтропения > 10 -15 дней алло. ТСГК Случаи ИГИ монитори нг 2 -5% НЕТ 15 -20% ДА 20 -30% ДА 5 Багирова Н. С.
Диагностические трудности при ИГИ – Неспецифические первоначальные симптомы – Выполнение исследований, устанавливающих окончательный диагноз, не всегда возможно – Лишь в 20%-30% случаев диагноз четко устанавливается при жизни Багирова Н. С. 6
Традиционные методы диагностики • • Микроскопия Культуральный метод Рентгенологические методы Гистопатологический метод • Низкая чувствительность • Не пригодны для ранней диагностики • Не всегда доступен качественный материал для исследования • Несколько дней для роста культуры Багирова Н. С. 7
Гистопатоморфологические методы диагностики ИГИ (гистохимический, иммуногистохимический, in situ гибридизация)(1) • Гистохимический метод: Достоинства - незаменим для дифференцирования колонизации, контаминации, инфекции Недостатки – неспецифичность (вид гриба не определяется, можно не отличить от элементов тканей) [Guarner J, and M. Brandt, Clin. Microbiol. Review, 2011] Багирова Н. С. 8
Гистопатоморфологические методы диагностики ИГИ (2) • иммуногистохимический метод: используются антитела для поиска антигенов в тканях Достоинства – комбинация морфологической диагностики и определения вида гриба Недостатки – неспецифичность (перекрестная реакция со многими видами грибов) [Guarner J, and M. Brandt, Clin. Microbiol. Review, 2011] Багирова Н. С. 9
Гистопатоморфологические методы диагностики ИГИ (3) • Метод in situ гибридизации: определение специфических нуклеиновых кислот грибов Достоинства – высокая степень специфичности по сравнению с 2 -мя предыдущими методами гистопатоморфологической диагностики Недостатки – не годится для скрининга (как галактоманнан, например) [Guarner J, and M. Brandt, Clin. Microbiol. Review, 2011] Багирова Н. С. 10
Лазерная микродиссекция: комбинация микроскопии с лазерными технологиями для изучения специфических типов клеток Достоинства – • высокая степень специфичности • Исключение контаминации исследуемого материала Недостатки – высокая стоимость 11 [Guarner J, and M. Brandt, Clin. Microbiol. Review, 2011] Багирова Н. С.
ПРЯМАЯ МИКРОСКОПИЯ • • с 10 -20% КОН (ногти, волосы, гной, мокрота. . . ) с/без добавления красителя с нигрозином (India ink) — ликвор с лактофенолом и 5% раствора синьки для х/б тканей — ликвор, плевральная, перитонеальная, синовиальная жидкости, моча, секрет дыхат. путей) По Граму (молодые клетки гриба) По May-Grunwald-Giemsa (для внутриклеточных форм Histoplasma capsulatum в периферической крови) По Папаниколау (в основном в гинекологии) PAS — окраска- один из наиболее часто используемых в гистологии - по Хочкиссу-Мак-Манусу 12 Багирова Н. С.
методы микроскопии на основе флюоресценции • коммерческие тесты: • Fungi-Fluor (Polysciences, Inc. , Warrington, PA, USA) • Blancophor ® (Bayer AG, Leverkusen, Germany) • Calcofluor White (Calcofluor White Reagent Droppers, Becton Dickinson Microbiology Systems). Багирова Н. С. 13
Калькофлюор белый: характерные гифы Aspergillus spp Багирова Н. С. 14
P. carinii в мокроте: иммунофлюоресценция Багирова Н. С. 15
Микроскопия (+) гемокультуры FISH: • флюоресцентная гибридизация. Идентификация за 1 час микроорганизмов, выросших при посеве крови или в любом биоматериале. Определяется от 10 клеток в 10 мкл крови (1000 клеток в 1 мл крови) Багирова Н. С. 16
ПОСЕВ БИОМАТЕРИАЛА (1) v. Наличие биоматериала v. Отрицательный результат не исключает ИГИ (качество биоматериала и проч. ) v. Специфичность 100% v. Определение антифунгальной активности Багирова Н. С. 17
Посев биоматериала (2) [A. C. Pascualotto and D. W. Denning, European Oncology Rev. , 2005] v. Кандидемия - ~50% v. Aspergillus spp – из мокроты 8 -34%, БАЛ - 45 -62% v. Fusarium spp – из крови 40%, +поражения кожи – до 60% v. Зигомикоз – из мокроты <25% v. Scedosporium prolificans - до 80% из крови Багирова Н. С. 18
Рост грибов из биоматериалов онкогематологических больных при фебрильной нейтропении ( КТ+): • 79% узловые затемнения • 24, 1% HALOпризнак • 48% выпот в легких • 37% затемнение в виде матового стекла • 31% уплотнение [Ho D. J et al, Mycoses, 2011] • Бронхоскопия – 12, 8% • Легкие (биоптат) – 35% • Синусы (биоптат) – 83, 3% Багирова Н. С. 19
Альтернативные методы диагностики микозов: экспресс-методы определение в биологических жидкостях: • антигенов • метаболитов • фрагментов ДНК • антител Багирова Н. С. 20
Platelia - ИФА 21
Pastorex – латексная агглютинация 22
Некультуральные методы (1): антитела - Определение антител в сыворотке (в основном Candida spp. - тест Platelia Candida Ab –ИФА) Могут не определяться при наличии инвазивного микоза Не позволяет отличить колонизацию от микоза (ФГБУ РОНЦ – (+) у 20% больных и у 5% доноров) Рост Aspergillus spp. в тканях больных с иммуносупрессией не сопровождается увеличением титра антител. Увеличение титра антител в конце иммуносупрессии - индикатор выздоровления от аспергиллеза, снижение титра антител – 23 неблагоприятный прогностический признак Багирова Н. С.
Некультуральные методы (2): антигены Candida spp в сыворотке Маннан (Candida spp. ): -латексная агглютинация, Pastorex Candida Ag, низкая чувствительность 25%, специфичность и прогностическая ценность (+)результата низкие - ИФА, Platelia Candida Ag, высокая чувствительность 85%, специфичность и прогностическая ценность (+)результата низкие - до 50% ложно(+) результаты Энолаза (Candida spp. ): чувствительность 54 -75%, если исследуется серия сывороток Багирова Н. С. 24
Некультуральные методы (3): антигены Aspergillus spp в сыворотке, моче, БАЛ, плевральной жидкости, ликворе -Галактоманнан (Aspergillus spp. , Penicillium spp. ): -латексная агглютинация (Pastorex Aspergillus Ag), низкая чувствительность 30%, высокая специфичность 95%), нет (+) результатов до клинических проявлений - ИФА (Platelia Aspergillus Ag), чувствительность 93%, специфичность 95%), ранняя диагностика - до клинических проявлений и КТ (у 80% за 8 дней и у 88, 8% за 9 дней), раньше латекс-аггл. (на 2 -3 недели), дольше (+) рез-ты, чем латекс-аггл. - до 1 -18% ложно(+) результаты - до 5 -10% ложно(-) результаты 25 Багирова Н. С.
Антигенемия (галактоманнан) Зависит от состояния больного, формы инфекции, степени инвазии сосудов. Может длиться от 1 недели до 2 -х месяцев Сыворотка – основной материал для исследования. Образцы второй линии должны приниматься в расчет только при параллельном исследовании сыворотки. В бронхоальвеолярной жидкости, плевральной, синовиальной, перикардиальной и спинномозговой жидкостях антиген часто определяется раньше, чем в сыворотке. В моче концентрация антигена ниже, чем в сыворотке, причем в моче антиген может вообще не определяться. 26 Багирова Н. С.
Экспресс-диагностика аспергиллеза: антиген галактоманнан (1) • Определяет антиген клеточной стенки аспергилл галактоманнан • наиболее информативен при нейтропении у взрослых • 4 часа (300 мкл БАЛ, сыворотка, проч. ) Серия сывороток Багирова Н. С. 27
Экспресс-диагностика аспергиллеза: антиген галактоманнан (2) • Галактоманнан в БАЛ (+) – только в 10 -58% случаев рост Aspergillus spp. (+) • Ложно(+) и ложно(-) результаты возможны • Перекрестная реакция возможна (Candida, Histoplasma, Geotrichum, Alternaria…) • Candida – перекрестная реакция для сыворотки слабая, но для БАЛ – значительная • Основные биоматериалы – сыворотка (индекс ≥ 0, 5 дважды), БАЛ (индекс ≥ 0, 8 однократно) • Предложено: Мокрота (индекс ≥ 1, 2), моча, ликвор • Мониторинг 3 -4 р в неделю (эффективность терапии, после 1 -го (-) результата – 2 недели и более (-) [Barton R. , 2013] Багирова Н. С. 28
Экспресс-диагностика аспергиллеза (1) [Park S. Y. , et al, 2010] • внеклеточный гликопротеин в фазе активного роста аспергилл • ИЛА (онкогематология, трансплантация солидных органов) • 15 минут (100 мкл БАЛ, сыворотка) • Чувствительность 100%, Специфичность – 81%, PPV 81%, NPV– 100% • Кросс-реакция (Candida, Penicillium) Багирова Н. С. 29
Экспресс-диагностика аспергиллеза легких (2) • Исследуется выдыхаемый пациентом воздух с целью обнаружения вещества 2 -пентил-фурана. Сообщение о двух больных аспергиллезом легких. Chambers et al. , Current Opinion in Pulmonary Medicine, 2012 Barton R. C. , Scientifica, Review Article, 2013 Багирова Н. С. 30
Экспресс-диагностика ИГИ: (1 -3)-ß-D-glucan (G-тест) • определяет широкий спектр грибов - Candida spp. , Aspergillus spp. , Fusarium spp. , Trichosporon spp. , Saccharomyces spp. , Acremonium spp, Pneumocystis jiroveci (carinii) за исключением Cryptococcus spp. (ограничено), Mycor spp. (отсутств. или низк. уровень (1 -3)-ß-D-glucan) • не дает (+) результатов при колонизации • высокая чувствительность и специфичность при ОМЛ и МДС • алло-ТСГК, сопровождающейся РТПХ, а также в других группах больных G-тест требует дополнительного изучения • Серия исследований увеличивает чувствительность и специфичность метода Багирова Н. С. 31
Рекомендации EORTC/MSG [de Pauw B. et al, CID, 2008], IDSA [Baron E. et al, Guide 2013, CID] • • Основное значение: анализ факторов риска ИГИ микробиологические данные Комбинация серологических тестов (галактоманнан при аспергиллезе, β-1, 3 -Dглюкан) + рентгенологические исследования гистопатологические исследования тканей и/или культуральное подтверждение инвазивного микоза - золотой стандарт диагностики ИГИ Багирова Н. С. 32
Биомаркеры при ИГИ ИНФЕКЦИЯ БИОМАРКЕР АНТИТЕЛА Candididiasis Aspergillosis АНТИГЕНЫ нет для ИА исследуется да (GM, Gтест, ДНК) Cryptococc. нет да Zygomycosis нет исследуется Histoplasmosis ограниченная да Blastomycosis ограниченная да Coccidioidom. да исследуется Paracoccidioid. да да Прочие плесн. нет исследуется [Patterson T. Trans. Am. Clin Climatol. Assoc. , 2011] СВЯЗЬ С ТЕРАПИЕЙ нет ограниченная нет да (АГ) неизвестно нет Багирова Н. С. 33
Рекомендации EFISG (Europ. Fungal Infection Study Group of ESCMID) по диагностике ИК инфекция материал Кандидемия Кровь сыворотка ИК, ХДК тест • Гемокульт • Манн/антим • G-тест • Кровь, сыво • Гемокульт ротка • Манн/анти • G-тест • Прямая микроск. и • Ткань и стер. жидк. гистопатол • посев рекомендации • ++ • ++ • ИК нет; ХДК + • ++ [Cuenca-Estrella et al, ESCMID guideline, Clin. Microbiol. Infect. , 2012] 34 Багирова Н. С.
Рекомендации EFISG (Europ. Fungal Infection Study Group of ESCMID) по диагностике ИА тесты цель рекомендации GM Ранняя диагност. ИА Серия сывороток+КТ ВР при ФН+ОЛ или алло. ТСГК; индекс ≥ 0, 5 дважды или ≥ 0, 7 однократно, если >1 - неудача в терапии БАЛ(>1) и ликвор (>0, 5): ФН+/ФН- Β-D-глюкан Диагност. ИГИ (G-тест) ПЦР Серия сывороток: ФН+/ФННизкая точность у онкогематол. Не для скрининга Диагност. В стадии исследования, не для ИА. повседневной практики Н/д по проч. ИГИ [Cuenca-Estrella et al, ESCMID guideline, Clin. Microbiol. Infect. , 2012] Багирова Н. С. 35
Благодарю за внимание ! E-mail: nbagirova@mail 36
52a78cb6657e47749b26d07e8e8f06fb.ppt