3 лекция
Экспрессия белков в прокариотической системе + Относительно высокая продуктивность; быстрый рост; низкая стоимость; просто в техническом исполнении - Ограничения по размеру экспрессируемого белка; проблемы с правильным фолдингом белка; отсутствие гликозилирования
Удачные примеры прокариотической экспрессии • Эпитопная библиотека фрагментов основного белка миелина
Неудачные примеры прокариотической экспрессии Экспрессия sc. Fv-антител КДа 116 66, 2 45, 0 35, 0 25, 0 18, 4 кл 30 о 20 о 30 о М Растворимые фракции из клеток штамма BL 21(DE 3), после индукции кл 20 о 30 о М кл 20 о 30 о Растворимые фракции из клеток штамма Origami B (DE 3), после индукции
Экспрессия белков в дрожжевой системе + Невысокая цена; высокий уровень экспрессии; возможность гликозилирования препарата - Существенно более медленный рост культуры по сравнению с прокариотами
Дрожжевые векторы • Векторы на основе дрожжевой интегрирующейся плазмиды YIp (yeast integrating plasmid), используются для встраивания рекомбинантной ДНК в хромосомы дрожжей. • Векторы на основе дрожжевых реплицирующихся плазмид YRp (yeast replicating plasmid). Эти плазмиды способны к автономной репликации в клетках дрожжей, благодаря наличию у них ARS-последовательностей (autonomously replicating sequences) Векторы семейства дрожжевых эписомных плазмид YEp (yeast episomal plasmid) получены из природной многокопийной кольцевой плазмиды дрожжей 2 μm, существуют в клетках дрожжей во внехромосомном состоянии в большом числе копий, автономно реплицируются и стабильно сегрегируют между делящимися клетками Векторы на основе дрожжевых центромерных плазмид YCp (yeast centromere plasmid), способны к автономной репликации и более стабильному существованию в клетках дрожжей в виде внехромосомных элементов. • •
Искусственная хромосома дрожжей YAC (Yeast Artificial Chromosome) trp 1 – восстанавливает способность к росту в отсутствие экзогенного триптофана ura 3 - компенсирующий генетический дефект клеток дрожжей, который нарушает биосинтез урацила TEL - теломерные последовательности , необходимые для репликации концов минихромосомы ARS 1 - область начала репликации CEN - последовательность центромеры. >2000 т. п. н.
Промоторы Конститутивные: ADH 1 – промотор алкогольдегидрогеназы I PGK – промотор фосфоглицерат киназы GAP – промотор глицеральдегид-3 -фосфат дегидрогеназы Индуцибельные: GAL 1, GAL 7 и GAL 10 – промоторы генов метаболизма галактозы + галактоза; - глюкоза PHO 5 – промотор гена кислой фосфатазы + недостаток по фосфату СUP 1 – промотор, индуцируемый Cu 2+ AOX 1, AOX 3 – промотор пероксисомальной алкоголь-оксидазы + метанол; - глюкоза FLD 1 Маркеры – промотор глутатион-зависимой формальдегидрогеназы + метанол/(NH 4)2 SO 4 или + глюкоза/метиламин Ауксотрофные: HIS 4, LEU 2, ARG 4, TRP 1, URA 3, ADE 2, CYH 2 Доминантные: зеоцин, G 418
Вектор p. PICZαA
Схема рекомбинации
Gene of interest Схема рекомбинации Gene of interest
Клонирование и экспрессия Fab-фрагмента антитела в дрожжах План Создание генетической конструкции для экспрессии тяжелой цепи Создание генетической конструкции для экспрессии легкой цепи Создание бицистронной генетической конструкции для одновременной экспрессии тяжелой и легкой цепей Трансформация конструкции в клетки Pichia Pastoris линии GS 115. Bgl. II Pme. I Bam. HI Bgl. II p. PICZa. A LCh p. PICZa. A HCh AOX 1 промотер α-фактор Ген Fab-Heavy chain His и с-myc теги AOX 1 TT терминатор Ген Fab-Light chain Bam. HI Pme. I Bgl. II Pme. I Bam. HI
Направленный мутагенез с использованием ПЦР и перекрывающихся праймеров 5’ 3’ A 3’ 5’ 5’ 3’ PCR 3’ 5’ B 3’ 5’ C 5’ 3’ PCR 5’ 3’ 3’ D 5’ 5’ Смешать + DNAPol 3’ D 3’ C 3’ PCR с праймера С и D
Вставка с использованием ПЦР и перекрывающихся праймеров 5’ 3’ 3’ 5’ A AB C 5’ 3’ 3’ 5’ CD D B PCR 5’ 3’ 3’ 5’
Делеция с использованием ПЦР и перекрывающихся праймеров 5’ 3’ 3’ 5’ A AB C 5’ 3’ 3’ 5’ D B PCR 5’ 3’ 3’ 5’ CD
Введение мутаций с использованием ПЦР и метил -чувствительной рестриктазы Dpn. I
Клонирование и экспрессия Fab-фрагмента антитела в дрожжах План Создание генетической конструкции для экспрессии тяжелой цепи Создание генетической конструкции для экспрессии легкой цепи Создание бицистронной генетической конструкции для одновременной экспрессии тяжелой и легкой цепей Трансформация конструкции в клетки Pichia Pastoris линии GS 115. Bgl. II Pme. I Bam. HI Bgl. II p. PICZa. A LCh p. PICZa. A HCh AOX 1 промотер α-фактор Ген Fab-Heavy chain His и с-myc теги AOX 1 TT терминатор Ген Fab-Light chain Bam. HI Pme. I Bgl. II Pme. I Bam. HI
Мутагенез 5’AOX 1 промотера Bgl. II GTT AAC GTTT AAAC CAAA TTTG CAA TTG Bgl. II Hind. III GTT AAC CAA TTG Hind. III Bgl. II GTT AAC CAA TTG Hind. III
Мутагенез 5’AOX 1 промотера Bgl. II Pme. I Hind. III Bam. HI Bgl. II/Hind. III p. PICZa. A Bgl. II Hind. III Bgl. II/Hind. III Bgl. II Hind. III p. PICZa. A Hind. III Bam. HI p. PICZa. A Bgl. II Bam. HI + Hind. III
Клонирование и экспрессия Fab-фрагмента антитела в дрожжах План Создание генетической конструкции для экспрессии тяжелой цепи Создание генетической конструкции для экспрессии легкой цепи Создание бицистронной генетической конструкции для одновременной экспрессии тяжелой и легкой цепей Трансформация конструкции в клетки Pichia Pastoris линии GS 115. Bgl. II Pme. I Bgl. II Bam. HI α-фактор Bgl. II Pme. I Ген Fab-Heavy chain His и с-myc теги AOX 1 TT терминатор Ген Fab-Light chain Мутант AOX 1 промотера Bam. HI p. PICZa. A LCh p. PICZa. A HCh AOX 1 промотер Hind. III Линеаризация по Pme. I Bam. HI
N-гибридная система AD X Двухгибридная Y Ген-репортер DBD-сайт Y AD A MS 2 Лиганд RN A RN R X Трехгибридная Y LX AD R MS 2 Ген-репортер DBD DBD-сайт
Создание генетической конструкции для экспрессии тяжелой цепи Heavy chain CAG GTG CAG ----------AAA TCT TGT Gln Val Gln ----------Lys Ser Cys
Создание генетической конструкции для экспрессии тяжелой цепи Heavy chain CAG GTG CAG ---------- AAA TCT TGT Gln Val Gln ---------- Lys Ser Cys Подготовка вектора Sac. II Xba. I Not. I 1. Xho. I 2. T 4 -pol CTC GAG AAA AGA --- CTC GAG CCG GAG CTC TTT TCT --- GAG CTC GGC Not. I CTC GA GAG CT Leu Gl Sac. II Xba. I G GCC CGG CTC GA GAG CT Leu Gl Not. I Xba. I TC GAG CCG --- GCG GC AG CTC GGC --- CGC CG 1. Рестрикция по Xho. I 2. «Тупление» концов T 4 полимеразой 3. Рестрикция по Not. I
Создание генетической конструкции для экспрессии тяжелой цепи Heavy chain CAG GTG CAG ---------- AAA TCT TGT Gln Val Gln ---------- Lys Ser Cys Подготовка вставки Hch forw ПЦР-продукты вставки G AAA AGA CAG GTG CAG -------- AAA TCT TGT GCG GC NNNNNN C TTT TCT GTC CAC GTC -------- TTT AGA ACA CGC CG NNNNNN Lys Arg Gln Val Gln -------- Lys Ser Cys Not. I Hch rev Рестрицированная вставка Not. I G AAA AGA CAG GTG CAG --------C TTT TCT GTC CAC GTC --------Lys Arg Gln Val Gln -------- AAA TCT TGT G TTT AGA ACA CGC Lys Ser Cys Xho. I CTC GA G AAA AGA CAG GTG CAG --------GAG CT C TTT TCT GTC CAC GTC --------Leu Gl u Lys Arg Gln Val Gln -------- + Рестрицированный вектор CTC GA GAG CT Leu Gl Not. I AAA TCT TGT GC G GCC TTT AGA ACA CGC CGG Lys Ser Cys G GCC CGG
Создание генетической конструкции для экспрессии легкой цепи VL-фрагмент CAG TCT GTG --------Gln Ser Val -------- AAT CCG GTA Asn Pro Val J-фрагмент CCGACTTTCGGCGGAGGTACCAAGCTCGAGATCAAACGT Pro. Thr. Phe. Gly. Thr. Lys. Leu. Glu. Ile. Lys. Arg C-фрагмент ACT GTG GCT -------Thr Val Ala ------- GGA GAG TGT Gly Glu Cys
Создание генетической конструкции для экспрессии легкой цепи VL-фрагмент CAG TCT GTG --------Gln Ser Val -------- AAT CCG GTA Asn Pro Val J-фрагмент CCGACTTTCGGCGGAGGTACCAAGCTCGAGATCAAACGT Pro. Thr. Phe. Gly. Thr. Lys. Leu. Glu. Ile. Lys. Arg C-фрагмент ACT GTG GCT -------Thr Val Ala ------- Идеальный вариант VL J C GGA GAG TGT Gly Glu Cys
Создание генетической конструкции для экспрессии легкой цепи VL-фрагмент CAG TCT GTG --------Gln Ser Val -------- AAT CCG GTA Asn Pro Val J-фрагмент CCGACTTTCGGCGGAGGTACCAAGCTCGAGATCAAACGT Pro. Thr. Phe. Gly. Thr. Lys. Leu. Glu. Ile. Lys. Arg C-фрагмент ACT GTG GCT -------Thr Val Ala ------- Порядок клонирования 1. J-фрагмент 2. C-фрагмент 3. VL-фрагмент GGA GAG TGT Gly Glu Cys
Создание генетической конструкции для экспрессии легкой цепи VL-фрагмент CAG TCT GTG --------Gln Ser Val -------- AAT CCG GTA Asn Pro Val J-фрагмент CCGACTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTCGAGATCAAACGT Pro. Thr. Phe. Gly. Thr. Lys. Leu. Glu. Ile. Lys. Arg C-фрагмент ACT GTG GCT -------Thr Val Ala ------- GGA GAG TGT Gly Glu Cys Анализ клонируемых фрагментов на наличие уникальных рестриктных или потенциальных рестриктных сайтов: Mfe. I Xho. I полилинкер Вектор Kpn. I Xho. I J-фрагмент Kpn. I VL-фрагмент CCGACTTTCGGCGGAGGTACCAAGCTCGAGATCAAACGT Pro. Thr. Phe. Gly. Thr. Lys. Leu. Glu. Ile. Lys. Arg
Создание генетической конструкции для экспрессии легкой цепи ПЦР-J-полилинкер Mfe. I Kpn. I Xho. I Not. I Bsp. MI Bsm. BI G AAA AGA T GAGACG TGTC TTT TCT A CTCTGC ACALys Arg ПЦР-C-фрагмент Xho. I Not. I Bsm. BI CGTCTCN NNNNNNN GCAGAGNNNNN ПЦР-VL-фрагмент Bsm. BI Xho. I CGTCTC AA AGA CAG TCT GTG ---- CTC GAG GCAGAG TT TCT GTC AGA CAC ---- GAG CTC Gln Ser Val ---- Leu Glu
Создание генетической конструкции для экспрессии легкой цепи Сборка окончательной конструкции Bsp. MI Xho. I Kpn. I Xho. I Not. I Bsp. MI Not. I
Клонирование и экспрессия Fab-фрагмента антитела в дрожжах План Создание генетической конструкции для экспрессии тяжелой цепи Создание генетической конструкции для экспрессии легкой цепи Создание бицистронной генетической конструкции для одновременной экспрессии тяжелой и легкой цепей Трансформация конструкции в клетки Pichia Pastoris линии GS 115. Bgl. II Pme. I Bgl. II Bam. HI α-фактор Bgl. II Bam. HI Pme. I Ген Fab-Heavy chain His и с-myc теги AOX 1 TT терминатор Ген Fab-Light chain Мутант AOX 1 промотера Bam. HI p. PICZa. A LCh p. PICZa. A HCh AOX 1 промотер Hind. III Линеаризация по Pme. I
Скачать презентацию 3 лекция Экспрессия белков в прокариотической системе
ГенИнж3.ppt