14 628 21 0001 Федеральная целевая программа Исследования

14. 628. 21. 0001 Федеральная целевая программа «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014— 2020 годы» Соглашение № 14. 628. 21. 0001 от 09. 2014 на период 2014 - 2017 гг. Приоритетное направление: Науки о жизни Программное мероприятие 2. 2 «Исследования связанные с созданием научно-технического задела в области промышленной биотехнологии/биоэкономики с участием научно-исследовательских организаций и университетов Федеративной Республики Германия» Тема: «Идентификация и гетерологичная продукция ферментов, гидролизующих ксилоглюкан в растительной биомассе» Руководитель проекта: С. В. Яроцкий Цели и задачи проекта Получатель субсидии 1. Федеральное государственное унитарное предприятие «Государстственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» Иностранный партнер Департамент Микробиологии Технического Университета Мюнхена (ТУМ), Германия (http: //mibio. wzw. tum. de) Основной вид деятельности Исследование термостабильных бактериальных гликозилгидролаз, предназначенных для деструкции растительной биомассы с целью получения ферментируемых сахаров. Роль в проекте Поиск, характеристика, исследование бактериальных ксилоглюканаз; синтез генов; получение и анализ ксилоолигосахаридов Цели проекта: 1. Cоздание штаммов-продуцентов новых и улучшенных ксилоглюканаз для более полной и эффективной конверсии растительной биомассы в продукты с высокой добавочной стоимостью, на базе промышленно-значимых микробных платформ, с использованием природного биоразнообразия и передовых подходов генетической инженерии. 2. Выполнение ФГУП «Гос. НИИгенетика» международных обязательств, зафиксированных в Договоре о сотрудничестве с ТУМ, относящемся к совместному проекту в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы» мероприятия 2. 2 «Исследования связанные с созданием научно-технического задела в области промышленной биотехнологии/биоэкономики с участием научноисследовательских организаций и университетов ФРГ» и второго мероприятия Международная Биоэкономика: Глобальная кооперация для Био-ориентированной Экономики, Модуль 2 «Био-Ге-Ру» BMBF. Задачи проекта: 1. Поиск и клонирование генов новых ксилоглюканаз из термофильных штаммов грибной коллекции ВКПМ; 2. гетерологичная экспрессия генов новых ксилоглюканаз в Pichia pastoris; 3. характеристика полученных штаммов и новых рекомбинантных ксилоглюканаз; 4. исследование продуктов гидролиза ксилоглюкана новыми рекомбинантными ксилоглюканазами. Перспективы практического использования Ожидаемые результаты проекта 1. опытные образцы чистых культур рекомбинантных грибных штаммовпродуцентов новых ксилоглюканаз (не менее трех). 2. лабораторные образцы ксилоглюканаз. 3. лабораторные образцы ксилоглюканов различной структуры растительного происхождения. 4. экспрессионные системы (векторы) для биосинтеза ксилоглюканаз в штаммах Pichia. 5. методика получения микробных штаммов-продуцентов ксилоглюканаз. 6. методика оценки продуктивности микробных штаммов-продуцентов ксилоглюканаз. 7. методика оценки функциональной активности рекомбинантных ксилоглюканаз. 8. методические рекомендации по применению новых рекомбинантных ксилоглюканаз. Экономическая значимость проекта состоит в расширении арсенала высокопродуктивных штаммов-продуцентов гликозилгидролаз с высокой специфической активностью, предназначенных для деструкции природного растительного сырья, отходов его промышленной и сельскохозяйственной переработки, гидролиза растительных полисахаридов с целью последующего использования продуктов гидролиза в биотехнологических процессах получения продуктов с высокой добавочной стоимостью. Новые ксилоглюканазы, обладающие промышленно-важными свойствами, могут быть использованы в целлюлознобумажной, текстильной промышленности, для приготовления кормов для животных, пищевых добавок, в составе ферментных комплексов для конверсии растительной биомассы, а также для ступенчатого гидролиза олигосахаридов с целью их структурного анализа либо получения специфических моносахаридов. Понимание механизма гидролиза КГ играет центральную роль в усилении ферментативного процесса деградации растительной биомассы. Исследование ферментов, гидролизующих КГ, необходимо для разработки способов защиты растений от патогенных микроорганизмов, использующих ксилоглюканазы для проникновения в растительную клетку. Высокоэффективные рекомбинантные штаммы P. pastoris могут быть использованы в качестве продуцентов термостабильной ксилоглюканазы. Новые ферменты будет использованы для получения ксилоолигосахаридов, а также для гидролиза растительной биомассы. Текущие результаты проекта B А GH 74 GH 12 1 Интегративная плазмидная конструкция для экспресии гена ксилоглюканазы GH 74 из M. thermophila в P. pastoris 2 M 1 2 M Электрофореграмма (A) и зимограмма(B) внеклеточных белков M. thermophila (1) и P. pastoris/mt 74 syn (2). Precision Plus Protein Dual Color Standard (Bio. Rad) (M) OD 600 140 120 2 100 1 80 60 40 20 0 Activity, U/ml 0 10 20 30 40 50 60 70 80 80 70 60 2 50 40 1 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Time, h Свойства рекомбинантной ксилоглюканазы из P. pastoris 14. 628. 21. 0001 Ферментация P. pastoris/mt 74 syn во флаконах (1) и биореакторе (2) 1. Выполнен скрининг коллекции ВКПМ, содержащей 607 грибных штаммов. Термофильные штаммы S. pruinosum, T. terrestris, S. thermophile и M. thermophila, гидролизующие ксилоглюкан при повышенной температуре (40 -45 °С), охарактеризованы и оценены по уровню ксилоглюканазной активности, температурному и p. H оптимуму и термостабильности нативных ксилоглюканаз. 2. Гены ксилоглюканаз семейства GH 74 идентифицированы в M. thermophila и S. thermophile. Нуклеотидная последовательность кандидатного гена mt 74 из M. thermophila оптимизирована для эффективной экспрессии в P. pastoris. Получена интегративная экспрессионная конструкция, содержащая синтетический ген mt 74 sin. 3. Проведена трансформация штамма P. pastoris GS 115. Выполнена селекция трансформантов P. pastoris/mt 74 sin, проведен отбор клонов по уровню внеклеточной ксилоглюканазной активности, выбраны наилучшие рекомбинантные продуценты. При культивировании во флаконах и биореакторе величина активности на КГ в КЖ составила 90 и 120 Ед. /мл, соответственно. Для сравнения, активность на КГ исходного штамма M. thermophila составила 1, 17 Ед. /мл. 4. 50% ферментативной активности рекомбинантной ксилоглюканазы сохраняется при р. Н 4. 5 -9. 0 и 55 -85°С. р. Н-оптимум 6. 5; максимум активности фермент проявляет при 70°С. Фермент сохраняет стабильность после инкубации в течение ночи в диапазоне р. Н 3. 5 -10. 0 и после 30 мин при 60°С. Полученные штаммы производят не менее 3 г/л целевого продукта, доля которого в общем содержании внеклеточных белков составляет не менее 40 %. 5. Выделены ксилоглюканы из тамаринда индийского, яблони домашней, настурции большой; определены структурные типы полученных ксилоглюканов. Проведен гидролиз КГ из тамаринда новыми рекомбинантными ксилоглюканазами из P. pastoris/mt 74 sin, исследована кинетика образования продуктов гидролиза и определен их качественный состав. Рекомбинантные ксилоглюканазы являются эндоксилоглюканазами и расщепляют цепь КГ на сстандартные моноблоки XXXG, XXLG(XLXG) и XLLG, а также способны гидролизовать моноблоки ксилоглюкана до более коротких олигосахаридов. 6. Предсказаны четыре потенциальных сайта N-гликозилирования рекомбинантных ксилоглюканаз в P. pastoris. Проведен гидролиз гликопротеинов ферментом Endo. H; показано, что гликозилирование ксилоглюканаз происходит только по одному сайту.