14 604 21 0069 Федеральная целевая программа Исследования

14. 604. 21. 0069 Федеральная целевая программа «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014— 2020 годы» Приоритетное направление: Науки о жизни Программное мероприятие: 1. 2 Проведение прикладных научных исследований для развития отраслей экономики Соглашение № 14. 604. 21. 0069 от 27 июня 2014 г. на период 2014 - 2016 гг. Тема: Создание новых рекомбинантных биокатализаторов с потенциальными фармакологическими свойствами методами комбинаторной биологии Руководитель проекта: академик Габибов А. Г. Получатель субсидии Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Индустриальный партнер Потребительское акционерное общество «Фармсинтез» . Фармацевтическая компания "Фармсинтез" основана в 1996 году в Санкт-Петербурге. На сегодняшний день в коллективе компании "Фармсинтез" работают девять кандидатов наук и семьдесят специалистов с высшим образованием. Компания постоянно обучает и повышает квалификацию своих сотрудников, добивается максимальной реализации трудового потенциала каждого специалиста. В 2006 году компания "Фармсинтез" получила сертификат ГОСТ Р ИСО 9001 -2008. Себестоимость продаж за 9 месяцев 2014 года составила 68, 018 млн руб. , валовая прибыль - 145, 684 млн руб. , прибыль до налогообложения - 26, 790 млн руб. Роль в проекте: материально-техническое обеспечение проекта и оценка и сопровождение РИД Ожидаемые результаты проекта 1. Оригинальные конструкции для экспрессии генов ферментов и каталитических антител на поверхности дрожжевой клетки и во внеклеточное пространство. 2. Библиотеки активных центров ферментов бутирилхолинэстеразы (Бу. ХЭ), энтерокиназы (ЭК) и каталитических антител A 17 и/или A 5. 3. Лабораторная методика скрининга библиотек активных центров биокатализаторов методом проточной цитофлуориметрией-сортингом (FACS) в эмульсионной системе вода/масло/вода. 4. Лабораторная методика получения химически полисиалированых рекомбинантных биокатализаторов. 5. Проект технического задания на ОТР по доклиническому исследованию новых биокатализаторов Цели и задачи проекта Цели ПНИ: Создание на основе генов иммуноглобулинов и ферментов биокатализаторов с заранее заданными улучшенными свойствами для обеспечения их пролонгированной работы в токе крови в качестве лекарственных средств или использования в биотехнологии. Задачи ПНИ: Создание комбинаторных библиотек генов активных центров ферментов и каталитических антител. Разработка и проведение высокопроизводительного скрининга комбинаторных библиотек генов. Совершенствование платформы по получению биокатализаторов с улучшенными фармакокинетическими свойствами для обеспечения их работы в токе крови в качестве лекарственных средств. Перспективы практического использования Область применения – медицина, фармакология, биотехнология, биохимические исследования, иммунология, онкология, фундаментальная медицина Биокатализаторы, проявившие максимальные биологические свойства в ходе экспериментальных исследований и с оптимальными потребительскими свойствами будут поданы на конкурс работ по выполнению ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» , утвержденной постановлением Правительства Российской Федерации от 17 февраля 2011 г. № 91. для проведения комплекса доклинических испытаний в соответствии с действующим в РФ регламентом. Текущие результаты проекта (А) Схема ультравысокопроизводительного скрининга биокатализаторов в каплях МДЭ. (Б) Микроскопия смеси 1: 10 активных и неактивных клеток (шкала – 100 мкм). (В) Эффективности скрининга смесей активных и неактивных клеток после 1 раунда отбора. 14. 604. 21. 0069 (А) Схема взаимодействия Бу. ХЭ и ФОТ. (Б) Кинетика ингибирования параоксоном Бу. ХЭ дикого типа (WT), мутанта cl 19, отобранного на GDС, и мутантов cl 14 и cl 15, отобранных на устойчивость к POX. (В) Мутант cl 14, в отличие от WT, демонстрировал каталитический гидролиз POX-R. Концентрации ферментов 0. 45 мк. M. (Г) Кинетические константы Бу. ХЭ дикого типа (WT) и мутантов, отобранных на устойчивость к POX и GDС. 1. Наработаны экспериментальные партии полисиалированных бутирилхолинэстеразы Бу. ХЭ-ПСА 24 и её мутантной формы Бу. ХЭ-14 -ПСА 24. В результате получено 56 мг Бу. ХЭ-ПСА 24 и 19. 6 мг Бу. ХЭ-14 -ПСА 24 при сохранении специфической удельной активности 82% и 72%, соответственно (оба препарата c чистотой не менее 95%). 2. Наработаны экспериментальные партии лучших вариантов рекомбинантной бутирилхолинэстеразы: рекомбинантной Бу. ХЭ – 50 мг, мутанта Бу. ХЭ-14 – 15 мг (оба препарата c чистотой не менее 95%). 3. Проведены исследования по оценке физико-химических свойств биокатализаторов: каталитических антител, полученных на основании компьютерных расчетов (L-L 47 R и L-L 47 K), и каталитических антител, отобранных методом скрининга комбинаторной библиотеки (клоны A 17/1, A 17/3, A 17/4, A 17/5, A 17/7, A 17/8, A 17/12, A 17/13, A 17/16, A 17/17 и мутантных форм бутирилхолинэстеразы – Бу. ХЭ-14 и Бу. ХЭ-23). 4. Установлено, что антитела L-L 47 R и L-L 47 K можно отнести к биологическим антидотам классического типа (не каталитическим) и рассматривать их как эффективные акцепторы параоксона, причем антитело L-L 47 K – лучший кандидат каталитического антитела для проведения биологических испытаний. Показано, что антитела A 17/1, A 17/3, A 17/4, A 17/5, A 17/7, A 17/8, A 17/12, A 17/13, A 17/16, A 17/17 не обладают значимой активностью по отношению к исходному субстрату фосфонату X, а также к субстрату, использованному для отбора. Полученные данные свидетельствуют, что отобранный из комбинаторной библиотеки клон Бу. ХЭ-14, сохраняет не только высокую связывающую активность во взаимодействии с параоксоном, но и демонстрирует способность реактивироваться после ковалентного связывания: клон Бу. ХЭ-14 является каталитическим антидотом.