1 Введение в молекулярную медицину под ред

1. Введение в молекулярную медицину / под ред. М. А. Пальцева. – М. : Медицина, 2004. - 496 с. 2. В. З. Тарантул. Геном человека: энциклопедия, написанная четырьмя буквами - М. : Яз. славян. культуры, 2003. — 389 с. 3. С. Примроуз, Р. Тваймен. Геномика. Роль в медицине. Пер. с англ. - М: БИНОМ. Лаб. знаний, 2008. - 277 с. 4. Н. П. Бочков. Клиническая генетика. - М. : Медицина, 1997. – 287 с. 5. Гинтер Е. К. Медицинская генетика. – М. : Медицина, 2003. – 448 с. 6. Франк-Каменецкий М. Д. Век ДНК. – М. : КДУ, 2004. – 240 с. 7. Мак. Конки Э. Геном человека. – М. : Техносфера, 2008. – 288 с. 8. Геномика-медицине. Научное издание/ Под ред. Академика РАМН В. И. Иванова и академика РАН Л. Л. Киселева. – М. : ИКЦ «Академкнига» , 2005. – 392 с. 9. Генетика. Учебник для вузов/ Под ред. академика РАМН В. И. Иванова. – М. : ИКЦ «Академкнига» , 2006. – 638 с. 10. Жимулев И. Ф. Общая и молекулярная генетика. - 3 -е изд. , испр. – Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2006. – 479 с.

СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ФИЗИЧЕСКИХ КАРТ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА ПОЛИМОРФИЗМ ДНК

«ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА» 1993 – 1998 гг. 1. Создание генетической и физической карт генома человека 2. Секвенирование генома Генетическое картирование – определение порядка генов на хромосоме на основе установления частот рекомбинации между генами

Принципиальная схема картирования неизвестных генов: генов • Выяснение группы сцепления; • Поиск ближайших фланкирующих маркеров; • Определение физической области (ДНКпоследовательности), включающей искомый ген; • Клонирование набора фрагментов ДНК, перекрывающих исследуемую область; • Выделение из этого набора клонов, содержащих транскрибируемые ДНК-последовательности, предположительно соответствующий гену или его фрагменту; • Анализ специфических м. РНК и клонирование к. ДНКпоследовательности; • Секвенирование и идентификация самого гена

Схема кроссинговера и рекомбинации гомологичных хромосом

Оценка сцепления между генами Метод максимального правдоподобия – подсчитывается десятичный логарифм шансов - lod (log of the odds) шансы (Pr, относительная вероятность, odds) = вероятность наблюдаемой родословной при условии, что два гена сцеплены (0 < Q < 0. 5) / вероятности при отсутствии сцепления (Q = 0. 5). lod > 3, гены локализованы в одной хромосоме, При значениях lod < 2 гены не сцеплены, то есть локализованы в разных хромосомах или на разных концах одной хромосомы. LIPED, CRIMAP и LINKAGE

1 сантиморган (с. М) = 1 % рекомбинаций = 1 млн. п. н. Общая длина генома человека около 3300 с. М Горячие точки рекомбинации и районы генома, где рекомбинация подавлена (центромерные и теломерные участки хромосом, блоки конститутивного гетерохроматина и др. )

Полиморфизм 1. Наследуемые вариации в структуре ДНК 2. Существование в популяции двух и более аллелей одного гена с частотой редкого аллеля 1 % и выше 1900 г. – Ландштейнер открыл первый генетический полиморфизм, система группы крови АВО 1955 г. – Смитис описал метод крахмального электрофореза, установил полиморфизм сывороточного белка гаптоглобина

Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) Саузерн-блоттинг Рестриктаза (эндонуклеаза) – бактериальный фермент, расщепляющий ДНК по определенной последовательности нуклеотидов (сайт рестрикции)

VNTR – полиморфизм (варьирующее число тандемных повторов) Мини – сателлитные повторы базовая последовательность до 80 нуклеотидов Обработка рестриктазой, электрофорез, денатурация и блоттинг по Саузерну Микросателлитные повторы Базовая последовательность из 2, 3 или 4 нуклеотидов Метод ПЦР Проявляются большим количеством аллелей, высокая гетерозиготность

Однонуклеотидный полиморфизм (ОНП, SNP) 1 на 100 – 300 нуклеотидов, диаллельный полиморфизм 1999 г. – Международный консорциум по ОНП, начало картирования ОНП 2001 г. – карта около 1, 5 млн. ОНП

1911 г. – картирован 1 -й ген человека на X хромосоме (ген цветной слепоты) 1968 г. – первый аутосомный ген к 1994 г. – картировано свыше 60 000 маркерных ДНК последовательностей, около 5000 структурных генов Центр по изучению полиморфизма у человека (Centre d‘Etude du Polymorhisme Humain – CEPH, Франция) 61 многопоколенная семья (CEPH - семьи) Создание полной генетической карты Расстояние между ближайшими ДНК – маркерами ≤ 5 с. М

Основные ферменты, используемые для манипуляций с ДНК • • Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) ДНК-лигазы ДНК-полимеразы Ферменты, модифицирующие ДНК (щелочная фосфатаза и полинуклеотидкиназа)

• Геномные библиотеки содержат гены и некодирующую ДНК, расположенную между генами • Библиотеки к. ДНК содержат только экзоны генов • Хромосомспецифичные библиотеки содержат отдельные хромосомы и их фрагменты

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Real-time PCR (ПЦР в реальном времени), технология Taq. Man и Beacоn “гнездовая” (“nested”) ПЦР, секвенирование ДНК Полиморфизм длин аплифицированных фрагментов (AFLP); расщепление Clevase I (CFLP); расщепление резольвазой (EMD); Анализы, основанные на лигазной реакции (LDR, LCR, Padlock); инвазивное расщепление олигонуклеотидов (Invader); Анализ конформации одноцепочечных фрагментов (SSCP); гетеродуплексный анализ; Хроматографические методы: Денатурирующая HPLC Технология ДНК-чипов Масс – спектрометрическое секвенирование